细胞培养及染色体制备.pptx

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细胞培养及染色体制备,细胞培养：

将从体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存生长并维持其机构和功能的方法。

培养对象：

单个细胞或细胞群克隆：

由单个细胞经培养后繁殖的纯细胞株。

细胞生长细胞培养细胞增殖体外培养组织培养器官培养,培养细胞生命期指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，大致都要经历原代培养期、传代期和衰退期，生命期如何主要取决于细胞的种类，性状和原供体的年龄等。

原代培养：

也称初代培养，指从体内取出组织细胞开始培养到第一次传代的时期，一般约14周，此期的细胞移动比较活跃，有细胞分裂但并不旺盛，且与体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。

原代培养是一系列的选择过程，最终将形成相对均一的细胞系。

传代培养：

指将原代培养一定时间后的细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中再培养称之为传代，一次传代约数天至一周，该期细胞增殖旺盛，并保留原有组织细胞的很多特性。

衰退期：

有限细胞系经过长期反复传代，细胞增殖变慢而至停止分裂，该期细胞形态轮廓增强，色泽变暗，细胞质内出现暗的颗粒样结构以及空泡状结构，胞质突起回缩，最后衰退凋亡。

细胞培养一代细胞生长基本过程,生长缓慢的潜伏期增殖迅速的指数增生期生长停止的停滞期（平顶期）,细胞培养贴附细胞的生长过程,潜伏期：

游离期-胞质回缩，胞体呈圆球形,10min一4h贴壁期-细胞贴附并伸展，原代10-24h潜伏期-有运动，细胞无增殖，分裂相少指数增生期：

分裂相增多，是进行各种实验最佳时期。

停滞期：

密度抑制，细胞停止增殖，传代,贴壁生长型：

必须贴附于支持物表面才能生长，是大多数动物细胞在体内生存和生长发育的基本方式，如羊水、绒毛等。

悬浮生长型：

于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，是少数动物细胞的生长方式，见于各种造血系统肿瘤细胞，淋巴细胞等。

细胞培养细胞的生长类型,细胞培养细胞基本形态,贴壁型细胞：

成纤维细胞型上皮细胞型游走细胞型多型细胞型,悬浮型细胞：

始终为球形,细胞培养细胞生长特点,接触抑制：

正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长，是区别正常细胞和癌细胞的标志之一。

密度抑制：

细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。

细胞培养单个细胞增殖过程,细胞周期：

DNA合成和细胞分裂分裂间期：

G1期（DNA合成前期S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期,）,有丝分裂期：

前期2030min中期2030min后期56min末期2030min,M期,细胞增殖方式有丝分裂,*染色体复制一次，细胞分裂一次，由1个母细胞变成2个子细胞，母细胞含2对染色体（2n=4），2个子细胞也同样含2对染色体，从而保持了亲子代细胞之间的遗传物质的稳定性。

细胞培养培养的基本条件,培养基：

天然培养基合成培养基无血清培养基成分血清、营养物质、促生长因子等PH值（7.2-7.4）渗透压合适的气体环境：

开放培养95%空气+5%二氧化碳培养温度:

人体细胞培养的标准温度为370.5,细胞生长载体：

试管培养板等。

培养瓶、培养皿、多孔培养,无毒、无污染,染色体：

人类的遗传物质染色体病:

染色体畸变所致的疾病。

数目畸变,：

整倍体，非整倍体，嵌合,体染色体畸变类型结构畸变：

缺失、重复、倒位、易位等。

发生率：

流产胚胎占50%、死产婴占8、新生儿死亡者占6新生活婴占5-10、一般人群占5；,染色体技术,人类46条染色体，一半来自父亲，一半条来自母亲。

人类基因组DNA约2.91109碱基对，分布于24条染色体，平均每条染色体DNA含1.3108碱基对。

一条染色体是一个DNA分子,中期染色体的形态结构,每一中期染色体由两条染色单体组成，互称姐妹染色单体，各含一条DNA链，通过着丝粒连接，着丝粒将染色体划分为长臂（q）和短臂（p）,术语,染色体分析,众数分析：

在一染色后的玻片标本上，选择分散度适当的分裂相进行染色体计数，该数值集中在某一数值就可定为这一标本的众数，正常的标本一般计数20-30个细胞，不同的实验室规定的标准略有差异。

核型分析：

选取长度适中，分散较好的分裂相，将其按Denver-Paris体系规定进行配对，最后排成照片的全过程，正常标本一般分析3-5个。

染色体显带技术,非显带技术使按照常规染方法制得的染色体标本，用Gimesa染色，使染色体均匀着色，主要特征为着丝粒的位置和染色体的相对长度，可发现整倍性和部分非整倍性核型，但无法精确辩认某一染色体的异常。

显带技术：

将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴呈现明暗或深浅相间的横行带纹，每对同源染色体的带型基本相同且稳定，非同源染色体的带型各不相同。

染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每条染色体及针对染色体异常疾病。

染色体显带技术发展至今，根据对染色体处理方法和染料的不同，已有十余种显带技术，包括G-显带、Q-显带，R-显带、T-显带（显示端粒）、C-显带（显示着丝粒）、N-显带（显示核仁组织区），其它技术还有姐妹染色单体互换技术、染色体原位杂交技术和染色体脆性位点检测技术等。

G显带,常规染色体,G显带染色体（300-500条带）,高分辨染色体（550-1000条带）,R带,C带,N带,9号chr,染色体制备技术,纺锤丝抑制剂：

秋水仙素、秋水仙胺、长春碱等，通过抑制纺锤丝蛋白的形成来使细胞分裂阻断在分裂中期，从而达到细胞分裂的同步化，获得大量的分裂相。

低渗处理：

0.075MKCl、0.8%柠檬酸钠等，使细胞膨大，染色体松散。

固定处理：

甲醇和冰醋酸（3:

1或2:

1）显带染色：

gimesa,染色体制备方法,培养,收获,（消化）,低渗,固定,分散,烤片,显带,接种量,秋水仙素等，破坏纺锤丝形成，分裂止于中期,胰酶溶液，消化法,KCl/柠檬酸钠溶液，细胞膨胀，染色体伸展,甲醇和冰醋酸（3:

1/2:

1），固定形态,染色体分散仪,80，3h,胰酶分带，gimesa染色,临床应用细胞遗传学产前诊断指征,35岁以上的高龄孕妇产前筛查出来的胎儿染色体异常高风险的孕妇曾生育过染色体病患儿的孕妇产前B超检查怀疑胎儿可能有染色体异常的孕妇夫妇一方为染色体异常携带者医师认为有必要进行产前诊断的其他情形,绒毛取材：

孕1013,，流产率1.0-,周+62.0%,羊膜腔穿刺：

孕1622周6，流产率0.5-1.0%脐血管穿刺：

孕18周之后，流产率1.0-2.0%,临床应用产前诊断方法,羊水：

充满于羊膜囊内的液体就称为羊水,在妊娠早期,主要是由母体的血浆通过胎膜进入羊膜腔的漏出液;在妊娠中晚期,胎儿的尿液成为羊水的主要来源。

羊水的成分中98%是水,另外含有少量的无机盐类、有机物荷尔蒙和脱落的胎儿细胞。

羊水中细胞：

主要来源于胎儿上皮结构,这些细胞形成于胚胎发育早期,部分保存着胚胎原始细胞。

羊水细胞基本形态,成纤维样细胞（F）：

在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。

上皮样细胞（E）：

在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。

羊水样细胞（AF）：

在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。

羊水细胞的两种不同培养收获方式,原位法,羊水细胞原位培养载体,羊水原位培养操作,离心,预培养加液,收获,换液,悬液:

培养基0.5:

0.5混匀,培养20-24h,出现3-4个大克隆，圆亮细胞多，秋水仙素,第6/7天开始观察贴壁生长情况,换液,4ml培养基，开放式培养,10ml羊水,羊水原位法培养操作,原位培养盒内收获的分裂相,