高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选.docx
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高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选
高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选
陈圣丰,谢珍玉,王世锋,欧阳吉隆,周永灿*
(海南大学海洋学院;海南省热带水生生物技术重点实验室,海口570228)
摘要本研究样品采自海南周边养殖水体和底泥,通过富集培养的方法,分离出300多株地衣芽孢杆菌,再从中筛选出12株产高蛋白酶活性野生型热带种地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
研究表明该地衣芽孢杆菌在30℃培养24小时,培养液中的蛋白酶分解脱脂奶中的蛋白质,蛋白酶水解圈直径高达14.16mm,与等量的10μg/ml的蛋白酶K作阳性对照,蛋白酶水解圈直径显著高于蛋白酶K(P<0.05),与同类地衣芽孢杆菌:
Pb-wc09011、Pb-wc09012相比,水解圈直径显著高于Pb-wc09011、Pb-wc09012(P<0.05)。
进而说明筛选出的12株地衣芽孢杆菌具有高蛋白酶活性。
本研究筛选出的多株具有高效蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌热带菌种,为今后研究利用微生物来净化养殖水体,分解养殖污水中的有机物及其他有害因子,调节养殖水体生态平衡,从而改善水质环境具有重要意义。
关键词地衣芽孢杆菌;高蛋白酶活性;热带种;筛选与鉴定
ThepolymorphismofLipopolysaccharidesisolatedfromVibrioalginolyticusstrainswithdifferentvirulence
ChenShengFeng,XieZhenyu,WangShifeng,OuYangJiLong,ZhouYongcan*
(KeyLaboratoryofTropicalAquaticBiotechnologyofHainanProvince;CollegeofMarineScience,HainanUniversity,Haikou570228,China)
Abstract:
Keywords:
Bacilluslicheniformis;Highproteaseactivity;Badila;Screeningandidentification
国家自然科学基金项目(30660144,30760190)、海南省高校硕士研究生创新科研课题(Hxwsy2008-01)资助。
第一作者:
陈圣丰(1983-),男,硕士研究生,研究方向:
水生生物病害防治。
*通讯作者:
周永灿(1968-),博士,教授,主要从事水生生物病害及其防治研究。
E-mail:
zychnu@
随着水产养殖集约化的发展,养殖水体的污染问题越来越严重,特别是氨氮污染。
近几年来,不断发生养殖生物氨氮中毒的事件,给水产养殖业带来了严重的经济损失。
如何解决养殖水体中的氨氮污染问题,已成为净化养殖水质的研究热点。
就目前来看,常用处理养殖水体氨氮污染及防治养殖生物氨氮中毒的方法主要有物理、化学和生物3种。
传统的物理及化学方法虽然见效快,但投入较大且容易引起二次污染,而生物法则被认为是未来最有潜力、最有发展前景的方法,因为生物法调节养殖水体水质,具有无毒、无残留、无副作用优点,同时也不会造成二次污染,克服了传统用农药或抗生素的一些弊端,还对养殖水体中的生态平衡起到一定作用。
芽孢杆菌属于对人畜无毒无害的微生态菌,在自然界分布广泛,国内外均允许将其用于饲料添加剂。
芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体、底泥中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机质分解,从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。
在分解过程中,有机物一部分转化为细菌胞体物质,而大部分被转化为细菌生命活动过程中所需能量。
氨气、氮气、二氧化碳等代谢的终产物从水中弥散到空气中。
通过这种方法,养殖水体中的氨氮和硝基氮可减少80%以上。
水产养殖中,底质饵料与大量排泄物的不断沉积,可导致水体有机负荷不断增加,水体溶氧减少,氨氮、亚硝酸盐浓度升高,这些环境因子的改变是导致养殖水体恶化的主要因素,是水产动物疾病频发的主要诱因,同时也是制约水产业持续发展的主要因素。
本文旨在总结已有的经验,通过对海南周边的养殖系统和天然海域海水及底泥中蛋白质降解菌的分离筛选,获得能降解蛋白质的产高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌,为探讨地衣芽孢杆菌在水产养殖中的应用提供参考,以期为养殖水体的有机物污染问题寻求一种更为安全有效的防治措施、为开发水质改良剂提供更多的备选菌。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株从海南周边的养殖系统和天然海域海水及底泥中分离筛选。
1.1.2培养基
(1)高温(50℃)高盐选择性培养基:
胰蛋白胨5g/L、酵母浸膏2.5g/L、葡萄糖1g/L、Agar琼脂13g/L、NaCl70g/L、pH7.5。
(2)LB普通海水液体培养基:
酵母浸膏1g/L、牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl30g/L,pH7.5。
(3)LB普通海水固体培养基:
上述
(2)中加入琼脂13g/L,pH7.5。
1.2 方法
1.2.1菌种的分离先将样品海水慢慢摇匀,若是底泥,与适量灭菌陈海水混合搅拌均匀,再分别用移液枪吸取100μm接入预先倾注好的芽孢杆菌选择性培养基平板表面,用玻璃棒轻微地涂布均匀,置于生化培养箱,50±1℃下孵育24h,平板培养基上生长出来的菌落作为出发初筛菌株。
1.2.2菌种的筛选
(1)上清液制备经初筛出来的芽孢杆菌,用接种环挑取颜色较均匀的单个菌落,接种于普通海水液体培养基试管中,30℃180rpm/min振荡培养24h,以6000rpm/min离心10min,收集上清液各10ml于干净离心管,0.22μm滤膜过滤除菌,-20℃保存备用。
(2)脱脂奶平板法测定蛋白酶活性琼脂2g,加灭菌陈海水95ml,在121℃高压灭菌15min,待温度降至55℃,加入5%的无菌脱脂奶5ml(0.22μm滤膜过滤除菌),充分混匀后倾注于无菌平板,每平板20ml,冷却后,用直径4mm打孔器在脱脂奶平板上打孔(据实验需要决定打孔数量),用移液器吸取上清液20ul接入脱脂奶平板孔内,用10μg/ml的蛋白酶K作阳性对照,无菌海水作阴性对照,用封口胶封闭平板保持湿度,置于30℃生化培养箱孵育24h,取出平板,用10%的三氯乙酸液固定2h,去除固定液后用考马斯亮兰G一250染色过夜,次日用脱色液充分脱色,平板背景呈蓝色,上清液中蛋白酶能分解脱脂奶中的蛋白质而使孔周出现透明环,游标卡尺测量孔周透明环的直径,直径越大,则蛋白酶活性越强。
1.2.3菌种的鉴定按照文献中芽孢杆菌属(Bacillus)典型的形态、特征、生化特征和测定核酸序列,对筛选出来的高蛋白酶活性菌株进行菌种的综合鉴定。
2结果与分析
2.1初筛共分离筛选出产蛋白酶的芽胞杆菌菌株300多株。
2.2复选从初筛菌株中筛选出12株产高蛋白酶活性芽胞杆菌,经鉴定为地衣芽孢杆菌为:
Pb-wc09001、Pb-wc09002、Pb-wc09003、Pb-wc09004、Pb-wc09005、Pb-wc09006、Pb-wc09008、Pb-wc09009、Pb-hk09001、Pb-hk09002、Pb-sp09001、Pb-sp09003,该地衣芽孢杆菌蛋白酶降解脱脂奶结果见表1。
表1地衣芽孢杆菌蛋白酶降解效果
温度/℃
直径/mm
菌株
30℃
proK
9.12
Pb-wc09001
10.24
Pb-wc09002
12.32
Pb-wc09003
10.30
Pb-wc09004
10.18
Pb-wc09005
14.16
Pb-wc09006
11.54
Pb-wc09008
11.64
Pb-wc09009
12.24
Pb-hk09001
11.44
Pb-hk09002
9.46
Pb-sp09001
11.32
Pb-sp09003
12.72
Pb-wc09011
0
Pb-wc09012
8.26
T-Test(单一样本):
指定值:
9.12
NH+一N含量显著低于对照组(P<0.05)
由输出结果可以看出,12个菌株的蛋白酶降解脱脂奶直径平均为11.46,标准差为1.31,均值误差为0.38。
本题中检验值为9.12,样本均值和检验值差为2.34,根据公式计算出的T值为6.216,得到的相伴概率为0.00。
95﹪的置信区间为(1.51,3.17),表示95﹪的样本差值在该区间。
假设显著性水平a为0.05,由于相伴概率小于a,因此拒绝H0,可以认为该12株地衣芽孢杆菌的均值和proK平均值相比,存在显著差异。
T-Test(单一样本):
指定值:
0
由输出结果可以看出,12个菌株的蛋白酶降解脱脂奶直径平均为11.46,标准差为1.31,均值误差为0.38。
本题中检验值为9.12,样本均值和检验值差为2.34,根据公式计算出的T值为6.216,得到的相伴概率为0.00。
95﹪的置信区间为(1.51,3.17),表示95﹪的样本差值在该区间。
假设显著性水平a为0.05,由于相伴概率小于a,因此拒绝H0,可以认为该12株地衣芽孢杆菌的均值和proK平均值相比,存在显著差异。
T-Test(单一样本):
指定值:
8.26
One-SampleTest
TestValue=8.26
t
df
Sig.(2-tailed)
MeanDifference
95%ConfidenceIntervaloftheDifference
Lower
Upper
直径
8.498
11
.000
3.2033
2.3737
4.0330
由输出结果可以看出,12个菌株的蛋白酶降解脱脂奶直径平均为11.46,标准差为1.31,均值误差为0.38。
本题中检验值为9.12,样本均值和检验值差为2.34,根据公式计算出的T值为6.216,得到的相伴概率为0.00。
95﹪的置信区间为(1.51,3.17),表示95﹪的样本差值在该区间。
假设显著性水平a为0.05,由于相伴概率小于a,因此拒绝H0,可以认为该12株地衣芽孢杆菌的均值和proK平均值相比,存在显著差异。
方差和标准差
从结果中可以看出此12株菌株的蛋白酶降解脱脂奶直径的方差为1.71,标准差为1.31,平均直径为11.46。
从结果中可以看出此15个蛋白酶降解脱脂奶直径的方差为10.47,标准差为3.24,平均直径为10.33。
单因素方差分析
2.3鉴定
2.3.1细菌菌落形态鉴定结果
菌落为扁平较大约为3~5mm、有缺刻,乳白色,接近圆形,24h前表面光滑且湿润微褶皱;24h后菌落表面粗糙且皱褶。
2.3.2生化鉴定结果
鉴于对以上12个菌株进行核酸序列测定结果考虑,最后以地衣芽孢杆菌标准菌株为参比菌株,选取Pb-wc09001、Pb-sp09001、Pb-hk09002、Pb-wc09005菌株进行部分生理生化特征测定、糖发酵试验、渗透压试验(表2)。
根据中国科学院微生物研究所细菌分类组编《一般细菌常用鉴定方法》[12]和《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)[13]对地衣芽孢杆菌的描述,确定Pb-wc09001、Pb-sp09001、Pb-hk09002、Pb-wc09005为地衣芽孢杆菌,与参比菌株生化特征基本一致。
表2菌株生理生化特征
Tab.2Morphologyandphysiologycharacteristicsofdifferentstrains
菌株
结果
试验项目
Pb-wc09001Pb-sp09001Pb-hk09002Pb-wc09005标准菌株
淀粉水解
明胶液化
硝酸盐还原
柠檬酸盐
葡萄糖
果糖
甘露醇
D-核糖
3%NaCl
6%NaCl
7%NaCl
10%NaCl
+++++
-----
+++++
-----
+++++
+++++
-----
-----
+++++
+++++
+++++
+++++
2.3.3核酸序列分析鉴定
Pb-wc09001
ggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttctgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttgctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagctaaaagccaccttttataattgaaccatgcggttcaatcaagcatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccaggatcaaactct
Pb-wc09002
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Pb-wc09003
ggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttctgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttgctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgcaagtggtagctaaaagccaccttttatgattgaaccatgcggttcaatcaagcatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctgacctaagggagcaagctcccgtcggtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccaggatcaaactct
Pb-wc09004
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