第二节聚合酶链式反应.ppt

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第二节聚合酶链式反应PolymerasechainreactionPCR,ContentofTable,一、PCR的定义二、PCR技术的优点三、PCR原理四、PCR的标准反应体系五、PCR反应五要素六、PCR类型及应用,一、PCR的定义,在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。

PCR技术的创建,Khorana（1971）等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

KaryB.Mullis（1944）,二、PCR技术的优点,特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,三、PCR原理,Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.Primerextension,Regiontobecopied,PCR技术原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

模板DNA变性：

加热至94左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火（复性）：

55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：

在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。

PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCRproduct,TargetAmplification,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824,1cycle=2Amplicon,2cycle=4Amplicon,3cycle=8Amplicon,4cycle=16Amplicon,5cycle=32Amplicon,6cycle=64Amplicon,7cycle=128Amplicon,PCR仪,四、PCR的标准反应体系,10扩增缓冲液10l4种dNTP混合物各200mol/L引物10100pmol模板DNA0.12gTaqDNA聚合酶2.5ul（Mg2+）1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,Home,五、PCR反应五要素,引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）,六、PCR的类型及应用,1、PCR的类型反转录PCR技术：

RNA的反转录与PCR的联合应用原位PCR技术：

在细胞内进行，不需要提取DNA实时PCR技术：

进行DNA的定量分析筑巢PCR彩色PCR多重PCR不对称PCR共享引物PCR差异显示PCR锚定PCR重组PCR,2、PCR的应用,研究-基因克隆、测序、分析突变诊断-细菌、病毒、寄生虫检测、诊断人类基因组工程-遗传图谱的构建、测序、表达图谱法医-犯罪现场标本分析肿瘤检测其他,法医学,个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。

有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。

对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。

什么是“DNA指纹技术”？

世界上除同卵双生外，几乎没有指纹一模一样的两个人，所以指纹可以用来鉴别身份。

研究表明，每个人的DNA都不完全相同，因此，DNA也可以像指纹一样用来识别身份，科学家经过特殊处理后会显示某种“图案”，看上去好像黑白相间的条形码，这种方法就是DNA指纹技术。

父父子母,现嫌1嫌2嫌3,