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黄世炮亲水色谱固定相研究进展
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本科生毕业(学位)论文
亲水色谱固定相研究进展
黄世炮
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黔南民族师范学院
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20年月日
亲水色谱固定相研究进展
黄世炮
黔南民族师范学院
摘要:
亲水作用色谱(Hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)作为一种新型的色谱分离技术,在分离极性化合物方面作用显著,被广泛的应用于药物分析、食品检验、代谢组学、蛋白组学等领域。
固定相作为色谱发展和应用的基础,对色谱的分离性能有着重要的影响。
本文通过对HILIC固定相的组成、结构和性能等进行了综述,为HILIC的应用提供理论支持。
关键词:
亲水色谱;固定相;强极性化合物
AnalysisofHydrophilicChromatographyStationaryPhase
Huangshi-pao
()
Abstract:
Hydrophilicinteractionchromatography(HILIC),asanewtypeofchromatographicseparationtechnology,hasasignificantroleintheseparationofpolarcompoundsandiswidelyusedindruganalysis,foodtesting,metabolomics,proteomics,etc.field.Thestationaryphase,asthebasisforchromatographicdevelopmentandapplication,hasanimportanteffectonthechromatographicseparationproperties.Inthispaper,thecomposition,structureandperformanceofHILICstationaryphasearereviewed,whichprovidestheoreticalsupportfortheapplicationofHILIC.
Keywords:
hydrophilicchromatography;stationaryphase;strongpolarcompounds
引言
色谱应用技术的研究和开发从100多年前就已经开始了,分离的物质由极性和中等极性逐步发展为所有极性段的化合物均能被分离,但是分离的效果也受到现代技术的制约。
反相色谱的分离是依赖于色谱柱对物质吸附作用,然后通过不同极性的流动相对化合物进行洗脱,实现对物质的分离和分析,但是存在着强极性化合物在色谱柱上无法保留的问题,因此不能普遍用于强极性化合物的分离和分析。
正相色谱和离子交换色谱可以部分补充反相色谱的不足,但是由于各自应用的局限性使得分离技术没有得到很大的突破[1]。
亲水色谱是一种新的分析方法,固定相是正相材料,反相的流动相进行洗脱,流动相中甲醇或(和)乙腈的占比在60%-95%之间,在这种有机相比例条件下,HILIC色谱分离过程中就不会再出现像正相色谱中不能完全溶解样品的现象,因此对于极性较强和对水溶性较大的物质有很好的的分离优势[2]。
HILIC有很好的保留和分离选择性、水溶性样品溶解性好、保留时间不受流动相水含量的影响以及与质谱检测能够有效兼容等优势受到了研究者青睐,在药品分析和食品检验等领域应用广泛。
随着药品和食品标准的提高、各项组学技术的快速发展以及色谱连用技术的迅速崛起,极性化合物的有效分离和检测受到了越来越多的关注[3]。
1990年,Alpert[4]提出了HILIC的概念,同时他在试验中发现了氨基酸反相和亲水洗脱顺序的差异性。
2006年,Hemstrom和Ingum[5]对HILIC的分离机理、分离材料和各方面的综合应用进行了全面综述,发现占主导的保留机理与溶质的性质和使用的固定相密切相关。
2010年,McCalley[1]的实验结果表明,HILIC的分离和分析作用的实现与HILIC复合了色谱分析原理中的诸多性质有关,色谱柱对样品的吸附作用,流动相与样品之间的分配和离子交换作用等在HILIC的分离分析过程中可能会全部存在。
HILIC色谱填料的固定相表面键合着与水有很好亲和性的氨基、酰胺基等强极性基团[6]。
最开始的HILIC是在正相色谱基础上实现的,如硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶等。
近年来,随着研究的深入,不同功能基团的HILIC技术得到了快速发展。
由于不同固定相的HILIC柱保留性质存在的较大的差异,为了更好的选择应用HILIC柱,本文主要从HILIC固定相的种类、结构和保留特性等方面进行综述。
一、未修饰硅胶固定相
生物学领域中需要分离的强极性化合物常会选用裸硅胶作为HILIC色谱柱的固定相(图1)。
硅胶是常用的色谱填料,硅胶的表面有丰富的硅羟基,硅羟基是一种与水有很好亲和性的物质,用作HILIC色谱的固定相填料能够实现对强极性化合物的有效分离。
硅羟基数目的不同所发挥的作用机理不同,HILIC色谱应用中可以根据物质的性质选择合适的硅羟基色谱柱,也可以根据所用的流动相和发挥分离作用的色谱原理选择合适的硅胶柱。
硅胶的制备方法影响了是否能够用于色谱材料中,通过碱性硅酸盐溶液沉淀的方法所制备的硅胶材料中混有较多的金属杂质,用于色谱填料中会影响HILIC的分离效果,因此一般不用此类制备方法所得的硅胶作为填料;硅溶胶在空气中凝结成形后制得的硅胶不存在金属杂质的问题,并且具有较好的稳定性,因此一般选用此种制备方法制得的硅胶作为HILIC的色谱填料[7]。
图1未修饰硅胶结构
硅胶的硅氢化过程改变了硅胶的基本性质,将硅氧化硅胶表面引入一些弱极性或非极性基团可以增加硅胶的疏水性,能够对弱极性化合物的分离提供新的选择性。
这种疏水性改性使得硅氢化硅胶显示出一些独特的性质,通常会产生双保留机理。
不同生产厂家由于所使用的硅胶材料、制备方法等的不同使得未修饰硅胶柱在分析物的保留、柱效和峰形上有很大差异[8]。
裸硅胶的表面没有键合其他物质,因此作为固定相来说,它存在着表面吸附较弱,结构不均一的缺点,同时由于硅羟基中羟基的氢离子显示一定的酸性,这种作用会使HILIC色谱在分离分析碱性化合物的过程中存在分离度和重复性差的问题,并且色谱柱的寿命也会受到很大的影响。
因此,选用裸硅胶作为HILIC色谱填料会影响色谱柱的分离和分析能力,色谱柱的寿命较短,不能充分利用资源也是造成该类色谱填料不能广泛应用的主要原因[9-10]。
二、极性基团键合硅胶固定相
(一)传统极性基团键合硅胶固定相
(一)氨基键合相
氨基键合相(图2)作为色谱填料应用于HILIC色谱分离中主要是对糖、有机酸、核苷等物质进行分析,对于糖类的分析已经有了近50年的历史,分析方法逐步成熟,推广应用于各种糖类化合物的分析中。
氨基键合相中的氨基显示一定的碱性,在对酸性化合物分离时会与酸性化合中的氢离子结合使酸性化合物能够在色谱柱上保留能力增强,同时通过离子交换作用使得酸性化合物被洗脱出来,实现了对酸性化合物的分离和分析。
离子交换作用的存在对于HILIC固定性的选择性有积极的作用,但是由于流动相平衡时间较长,不可逆吸附和键合相的流逝,容易造成酸性化合物的保留时间过长或者峰形拖尾等问题,氨基柱的柱效和分离效率相对较低[11]。
图2氨基键合相
(二)二醇基和氰基键合相
硅胶二醇基键合相(图4)在HILIC色谱中常用于分离分析蛋白和低分子量的苯酚化合物。
二醇基键合相中的醇羟基的极性较强,与游离氢形成氢键的能力要优于裸硅胶,同时由于酸性的降低,因此二醇基键合相不存在离子化作用,使得HILIC二醇基色谱柱的寿命延长。
与氨丙基硅胶柱相比,二醇基柱在酸性条件下可以缓慢的释放、伸展键合相,使多糖异构体和有不同环结构的多糖得到分离[12]。
交联的二醇硅胶相比未交联的二醇硅胶相有更好的水解稳定性、更强的憎水性、更好的峰形和分离度。
氰丙基硅胶(图3)色谱开始使用的时间较早,但是目前已经很少用于实验研究中,这可能与缺少形成氢键的能力有关。
文献报道氰丙基硅胶在高有机溶剂水流动相中,极性化合物的保留很弱。
在HILIC条件下,氰丙基硅胶相的机械稳定性会变差。
由于氰丙基硅胶存在着这些诸多问题,限制了它的使用[13]。
图3氰基键合相
图4二醇基键合相
(二)改良的极性基团键合硅胶固定相
正相色谱柱的发展是基于反相色谱柱的基础,种类较少,分离效果较差。
由于键合的物质大多数为氨基,氨基的碱性集团的选择性较差,并且对于弱酸性物质会产生不可逆的吸附,导致使用寿命存在很大缺陷[13],其应用范围有限。
因此新型的专们用于HILIC固定相材料的出现和发展迅速,在HILIC柱上得到了很好的应用。
(一)酰胺键合相
酰胺键合相的HILIC色谱柱对于低聚糖、糖蛋白、苷类等物质的分离效果较好,同时能够很好的分析两性聚合物的样品。
酰胺柱的特点是酰胺基的作用使得色谱柱对强极性化合物的保留效果要显著优于裸硅胶,同时酰胺键合相酰胺基中的氨基不受离子交换作用的影响,几乎不会产生不可逆吸附作用,分析样品的稳定性较好,可离子化样品也不会受到离子交换作用的影响[14]。
同时,由于氨基酰胺柱分析过程中不需要离子化流动相,因此液质联用的分析,不会影响样品的离子化过程。
图5酰胺型键合相
(二)醇羟基键合相
醇羟基具有很到额亲水性,醇羟基的反应活性较低,在色谱材料应用中具有稳定相好的优势,不受被分离物质的影响,因此常用于分离离糖、氨基酸、肽类等强极性物质。
二元醇在HILIC色谱中的应用时间较长,新出现的多元醇羟基作为色谱填料比多元醇更有分离优势,多元醇的空间机构较好,能够对强极性化合物实现更好的分离效果[15]。
醇羟基的HILIC固定相主要有单羟基固定相、多元羟基固定相、环糊精固定相(ClickCD)、葡萄糖固定相(ClickGlucose)和麦芽糖固定相(ClickMaltose)[16]等。
环糊精的结构特性使得它在分离强极性化合物方面的应用更为广泛,环糊精分子的外表面具有很好的亲水性,但是内腔发挥疏水的作用。
这种特异性的机构使得环糊精能够用于分离糖醇、单糖、寡糖和极性化合物。
ClickCD(图6)除了具有HILIC所有特性,还能对弱极性化合物有反相色谱的作用。
与TSK-GELAmide-80相比,ClickCD对氨基酸的保留效果、稳定性和重现性更好。
环糊精柱和硅胶柱联合使用分离了一些在RPLC条件下无法分离的黄酮和异黄酮化合物[17]。
图6β环糊精结构
(三)两性离子固定相
两性离子键合硅胶的正电荷中心和负电荷中心同时存在,但是在表面却没有表现出很强的电荷效应。
两性离子键合硅胶色谱柱的应用从分离分离无机盐和离子化合物开始,后来逐步用于色谱分离分析中,成为HILIC色谱分析的填料。
磺酸甜菜碱键合硅胶相和磷酰胆碱固定相是较为常用的两性离子键合硅胶相。
磺酸甜菜碱键合硅胶相对水有很强的吸附作用,它的应用范围在小分子极性化合物,同时对各种代谢产物也能实现很好的分离。
磷酰胆碱固定相基团的排列顺序与磺酸甜菜碱键合硅胶相不同,因此氨基酸、羧酸等的洗脱顺序在两种两性离子固定性中是不一致的[18]。
三、其它极性基团改性的硅胶固定相
氟化硅胶键合固定相也可以用于分离芳香胺、卤代芳香化合物和其它极性芳香化合物。
巯基乙醇硅胶柱和硫代甘油硅胶的应用广泛,具有HILIC和RPLC的双重性质,在两种分离模式下均能得到很好的效果,但是分离样品后检测器检测的出峰时间和出峰顺序上存在着很大的差异。
通过反应将各种糖共价键合于硅胶表面,可以制备得到各种糖类固定相,在HILIC条件下,可以分离强极性的氨基酸、糖肽、寡核苷酸和天然产物。
Persson[19]等人发现,在硅胶表面嵌入聚合甲基丙烯酸山梨醇得到的固定相的分离选择性与商用的极性硅胶键合柱、裸硅胶柱相比,显示出巨大的差异。
混合模式的离子交换色谱柱也可用来分离极性、弱极性,甚至非极性化合物[20]。
四、有机聚合物基质的固定相
有机聚合物基质固定相的分离通常受表面存在的两性离子基团的影响和制约,分离的物质一般是糖和中性化合物。
研究人员最早借助苯乙烯基的阴、阳离子交换树脂在HILIC条件下分离多糖和中性样品,非离子性样品的保留随乙醇水流动相中乙醇浓度的增大而增加,苯乙稀二乙烯基苯树脂柱的柱效较低,分析时间较长,但是分离的选择性却非常高。
表面存在氨基基团的聚合物基质固定相通常被用来分离寡糖和生物材料中的氟尿嘧啶,以及碳水化合物富集体中的牛磺酸和蛋氨酸[21]。
聚合物基质固定相能够更好的分离物质,并且这种分离不受外界条件的影响,色谱分离过程中仪器的稳定性较好,分离效果不受分析时间的影响,能够得到较好的重现效果,并且色谱柱的使用寿命要显著高于裸硅胶。
作为硅胶柱的补充应用,聚合物基质固定相在强酸或者强碱或者硅胶不能分析分离的条件下会被用来分析分离样品。
有机聚合物整体柱的微观结构为相互粘连的聚合物微珠,特有的大孔-流通孔能能够保证大部分流动相直接流过,介孔或微孔会保留极少部分的流动相。
因此,聚合物整体柱非常适合于大分子的快速分离,尤其是蛋白分子,而小分子会进入纳米尺度的小孔中,在分离过程中很难被洗脱出来,峰展宽现象严重。
聚合物固定相对小分子的分离效果差,柱效低,不适宜用于小分子的分离。
常用制孔剂与强极性单体混溶性差是聚合物整体柱发展受限的主要原因,用极性、亲水性基团对聚合物整体柱进行改性后可以解决这些问题。
Courtois[22]等人将聚乙二醇作为制孔剂的一部分添加到聚合体系中,制得高极性亲水柱,该固定相获得的大孔与蛋白分子兼容,不会引起蛋白的折叠和失活。
Viklund[23]采用光引发共聚反应制备了一种富含磺酸烷基甜菜碱两性离子,可以用于阳离子交换模式分离蛋白的聚合物整体柱。
研究显示聚合时二甲基丙烯酸的浓度和致孔剂溶液的成分可以影响磺酸甜菜碱整体柱的多孔性、渗透性、选择性和保留特性,而且增加温度可以改善分离[24]。
有机聚合物整体柱在HILIC条件下还可以应用于毛细管电色谱,并且显示出高的柱效。
Li[25]等人在石英毛细管的内壁上进行热聚合得到了两性毛细管整体柱,对于中性、碱性和酸性极性物质的分析效果较好。
五、结论
强极性化合物的分离和分析仍旧是目前需要关注的重点,如何通过提高色谱填料的种类和水平来达到分离和分析的目的是未来一段时间的研究需要关注的重点,也是色谱填料研究的慢点。
对于HILIC色谱分离分析的机制研究没有做到像RPLC那样系统和准确,但是通过对不同的色谱填料的性质进行研究也是突破研究的方法之一,因此对于色谱填料应用范围的扩大仍旧需要我们的努力。
同时对HILIC色谱柱的评价方法和标准评价样品并不一致,很多色谱生产厂家给出的色谱柱评价采用的也仅是几个样品的检验结果,不能全面反映色谱柱的特性。
因此后续的研究应更多的关注HILIC色谱固定相的评价标准的建立。
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