小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定.docx
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小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定
*******大学
综合性实验报告
实验名称:
小型发酵罐的使用与发酵
过程中主要生化指标测定
实验性质:
综合性实验
所属课程名称:
发酵工程工艺原理
班级:
学号:
姓名:
实验指导教师:
小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定
摘要
为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况,本实验以分批培养法培养大肠杆菌,通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数,并每小时取样测OD值和还原糖量,制作菌体生长曲线,以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。
结果表明大肠杆菌在发酵的前三个小时处于生长延迟期,发酵3~6小时为对数生长期,发酵6小时后该菌开始进入平衡期,第8小时时结束发酵实验。
关键词:
发酵、大肠杆菌、菌体生长曲线
前言
大肠杆菌在生物技术中的应用十分广泛,大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。
发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。
生产上使用的发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用的小型发酵罐,其容积可从约1L至数百升或稍大些。
一般来说,5L以下是用耐压玻璃制作罐体,10L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。
发酵罐配备有控制器和各种电极,可以自动地调控试验所需要的培养条件,是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备[1]。
在当今市场上,各厂家生产的发酵罐会有所差别,但基本原理是相同的,基本结构是类似的。
本实验使用的是BIOTECH-7BGZ发酵罐,其结构主要又罐体和控制器两大部分组成,罐体为一硬质玻璃圆筒,底和顶两端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成,容积为5L,顶盖上有多个孔口,分别是加料及接种口补料口、放置DO(溶解氧)电极口、放置pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口等[2];本罐可配置不同性能的控制器,控制器能完成最基本的功能,它由下列几部分构成:
⑴参数输入及显示装置,用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度,pH、DO(溶氧)的测定数值。
⑵碱泵和酸泵分别用以向发酵罐加入碱液和酸液以调节培养液中的pH;
⑶消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂,以消除发酵过程中产生过多的泡沫。
⑷自动或人工控制按钮用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。
⑸电极连接导线:
有三条连接导线,分别与pH、DO和AF(消泡)电极连接。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1菌种
大肠杆菌(E.coil)
1.1.2培养基配方
种子培养基:
葡萄糖1.0g,蛋白胨1.0g,酵母膏0.5g,牛肉膏1.0g,氯化钠0.5g,水1000mL,pH7.0。
发酵培养基:
葡萄糖20g,蛋白胨10g,酵母膏5g,牛肉膏10g,氯化钠5g,氯化铵5g,水1000mL,pH7.0。
1.1.3仪器设备
BIOTECH-7BGZ发酵罐一套(配套蠕动泵、pH电极、溶氧DO电极、空压机及所有连接管)、分光光度计、旋转式摇床、离心机、冷藏箱、滴点装置、电子天平、电磁炉等。
1.1.4用具
烧杯、三角瓶、量筒、保鲜膜、玻璃棒、比色杯、试管、离心管、移液管、波珠等。
1.1.5试剂
泡敌、婓林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。
1.2实验方法
实验流程:
培养24h培养12h培养10h
菌种→斜面——→一级种子——→二级种子—————
37℃(250mL摇瓶)37℃(500mL摇瓶)37℃
培养基
↓8~10h
发酵罐——→管路准备→实罐灭菌→发酵——→放罐
37℃
↓
取样→分析测定
1.2.1菌种准备
1.2.1.1配制种子培养基
⑴配制种子固体培养基100mL,分装试管,0.1MPa(121℃)灭菌20min,然后摆成斜面。
⑵配制种子培养液500mL,各分装50mL于两个250mL三角瓶中(作一级种子瓶),余下的培养液装进三个500mL的三角瓶中(作二级种子瓶),0.1MPa(121℃)灭菌20min。
1.2.1.2接种与培养
⑴上罐前两天,从冰箱中取出菌种转接斜面,37℃培养24h。
⑵上罐前一天,由斜面菌种转接一级种子瓶,37℃振荡(125r/min)培养12h,然后转接二级种子瓶,37℃振荡(125r/min)培养10h。
1.2.2上罐前的准备及实罐灭菌
⑴洗净发酵罐及各联接胶管。
⑵配制发酵培养基4000ml,置发酵罐内,视情况加入几滴泡敌。
⑶安装好发酵罐,把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后,开夹套溢流口V2、进水阀W1,使夹套充满水。
⑷用保护罩盖住罐盖及发酵罐,用倾倒螺钉锁紧法兰,开保护罩顶部排气阀V4,启动蒸汽发生器,启动搅拌马达,调转速300r/min,开启冷凝水出水阀V1,开进水阀门S1,进行在位灭菌。
⑸将灭菌温度设为115℃,保温时间0.33h,设为自动。
当达到795s时,灭菌温度达到121℃。
⑹灭菌结束后,不打开保护罩,使发酵罐自然冷却至室温。
⑺用75%酒精消毒pH电极和DO电极,接入发酵罐,连接各电极导线。
⑻流加碱的管线与泵和罐体连接,通过面板操作开关选择碱泵,打开手动开关,使胶管内充满液体,将输出上限设为15%,下限设为0,待一切准备就绪,将“手动”开关调节到“自动”状态。
⑼设定搅拌转速为300r/min,空气流量2~3L/min、pH7.0、DO100%,系统进入发酵状态。
1.2.3发酵操作
⑴当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后,取样(用于接种前培养基成分分析):
松开弹簧夹J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内,再夹紧J2,将出料管放入接料瓶,松开取样管弹簧夹J3,发酵液被压入接料瓶,开J2、J3排出取样管内残料,夹紧J2、J3。
⑵接种:
将酒精棉置于接种口槽中,旋松接种口,点燃酒精棉,在火焰保护下,打开接种口,倒入二级种子,然后旋紧接种盖,移取火焰圈。
接种后立即进行第一次取样,用于测定细菌OD值。
1.2.4发酵管理
⑴控制发酵过程的各项参数(温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等),如参数出现异常现象,则应及时排除。
⑵每小时取一次样,每次取样50ml。
取样时先将空气流量计旋钮调至0~1L/min,松开弹簧夹J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内,再夹紧J2,将出料管放入接料瓶,松开取样管弹簧夹J3,发酵液被压入量筒,当达到40mL,开J2排出取样管内残料,夹紧J3、J2。
将样液入标记有取样时间的三角瓶,用保鲜膜封口,立即入冰箱冷藏,取完样要及时清洗量筒。
3每次取样前(每隔1小时)记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测
定数值,并记录操作情况。
1.2.5发酵过程中各生化指标的测定
1.2.5.1测定OD值
⑴大肠杆菌标准曲线的绘制:
取10mL离心管,与105℃烘2h至恒重,用镊子夹取入干燥器,待冷却后于分析天平上称重(W0),精确到小数后4位,然后准确取10mL发酵液,于3000rpm离心10min,弃去上清液,用蒸馏水洗涤沉淀,同上离心,弃上清液,与100℃烘至恒重,用镊子夹取如干燥器中冷却,于分析天平上称重(W1),精确至小数后4位,得细胞干重为W1-W0。
取同一发酵液,稀释2、5、10、20、50倍,于600nm下测OD值。
以0D值为纵坐标,菌液浓度(g/L)为横坐标,绘制标准曲线。
⑵均匀取样品5mL于编号试管中,用空白发酵液稀释至一定浓度,在721分光光度计上测定A600,根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。
⑶其余发酵液于3℃,2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶,用于测糖。
1.2.5.2测定葡萄糖
⑴样品处理:
用蒸馏水对样品液进行稀释待用。
⑵标定碱性酒石酸铜溶液:
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液,置于150mL锥形瓶中,加水10mL,加入玻璃珠2粒,混匀,从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液,控制在2min内加热至沸腾,趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液,直至溶液蓝色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积,同时平行操作三份,取其平均值,计算每10mL(甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)。
⑶样品溶液预标定:
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液,置于150mL锥形瓶中,加水10mL,加入玻璃珠2粒,混匀,控制在2min内加热至沸腾,趁沸以先快后慢的速度,从滴定管滴加样品溶液,并保持溶液沸腾状态,待溶液颜色变浅时,以每两秒1滴的速度滴定,直至溶液蓝色刚好褪去为终点,记录样液消耗体积。
4样品溶液测定:
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液,置于150mL锥形
瓶中,加水10mL,加入玻璃珠2粒,混匀,从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的样品溶液,使在2min内加热至沸腾,趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液,直至溶液蓝色刚好褪去为终点,记录样液消耗体积,同法平行操作3份,得出平均消耗体积。
⑸结果计算:
,式中:
c——葡萄糖标准溶液的浓度,mg/mL;
V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积,mL;
V1——测定时平均消耗样品溶液体积,mL;
N——被测样品稀释倍数。
1.2.6放罐
⑴发酵8小时后,测OD值及还原糖量,当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢,且还原糖量很低时,可判断发酵结束,准备放罐。
2放罐操作同取样。
将全部发酵液取出后,100℃煮沸10分钟灭菌,灭完菌的发酵液可排放入下水道。
1.2.7清洗
⑴放罐完毕后,打开自来水进水口,往发酵罐中注满水,同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟,排水。
⑵再次注入自来水清洗,操作如1。
⑶清洗结束,关闭电源。
2.结果与分析
2.1实验结果
2.1.1发酵过程数据结果
⑴每小时记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值,结果如下表:
表1发酵过程各参数值
时间
发酵时间
h
温度℃
pH值
DO
%
通风
L/min
转速
r/min
取样
mL
空白
37
7.0
100
2-3
300
200
8:
30
0
37
7.0
109.0
2-3
300
50
9:
30
1
36.9
6.98
124.1
2.5
304
50
10:
30
2
36.8
6.97
115.6
2.5
303
50
11:
30
3
36.9
6.92
44.0
2.8
303
50
12:
30
4
36.9
6.74
46.2
3.0
303
50
13:
30
5
37.0
6.72
43.4
2.0
303
50
14:
30
6
37.0
6.94
42.1
2.0
303
50
15:
30
7
36.9
7.39
38.9
2.0
303
50
16:
30
8
36.9
8.06
37.1
2.0
303
50
取完最后一次样品后放罐
⑵大肠杆菌标准曲线绘制如下所示:
下表2为所测菌液浓度与OD值间的关系表。
表2菌液浓度与OD值的关系表
干菌体浓度(g/L)
1.160
0.580
0.232
0.116
0.058
0.0232
测得OD值
1.431
0.771
0.481
0.269
0.127
0.043
根据表2得到两者的关系曲线图1,如下图:
图1菌液OD值与干菌体浓度关系图
得大肠杆菌干菌体浓度x与菌液OD值y之间的关系为:
y=0.8433x-0.0773
则x=(y+0.0773)/0.8433
⑶测定不同时间发酵液的OD值,确定对应时间的菌液浓度,结果如下表:
表3发酵液OD值与菌液浓度关系表
发酵时间(h)
发酵液(mL)
空白培养基(mL)
稀释度
OD值
(y值)
x=(y+0.0773)
/0.8433
干菌体浓度(g/L)
0
5
0
1倍
0.079
0.185
0.185
1
5
0
1倍
0.255
0.394
0.394
2
5
0
1倍
0.632
0.841
0.841
3
1
4
5倍
0.433
0.605
3.02
4
1
4
5倍
0.750
0.981
4.90
5
1
9
10倍
0.729
0.956
9.56
6
1
9
10倍
0.872
1.13
11.3
7
1
9
10倍
0.899
1.16
11.6
8
1
9
10倍
0.930
1.19
11.9
⑷测定不同时间发酵液的葡萄糖浓度,结果如下表:
表4培养液中葡萄糖含量表
编号
0
1
2
3
4
5
6、7、8
空白
稀释倍数/倍
18
15
12
10
6
3
—
—
消耗体积/mL
1
9.17
7.79
5.85
6.08
4.53
4.17
—
9.51
2
9.01
7.70
5.99
6.01
4.67
4.20
—
9.28
3
9.41
7.91
6.19
6.09
4.51
4.16
—
9.61
平均消耗体积/mL
9.20
7.80
6.01
6.06
4.57
4.18
—
9.47
还原糖含量/g/L
18.53
18.21
18.91
15.63
12.43
6.80
—
—
2.1.2数据整理及分析
由于pH值、DO值%、干菌体浓度(g/L)、葡萄糖浓度(g/L)等数据的数值范围相差较远,难以在同一个坐标图中综合分析,故根据发酵过程中,表1的pH值、DO值%,表3的干菌体浓度(g/L),表4的葡萄糖浓度(g/L)等数据结果,整理成下表:
表5发酵过程各参数数据表
发酵时间h
pH值(×0.1)
DO值%
干菌体浓度(×0.1)g/L
葡萄糖浓度(×1/6)g/L
0
70
109
1.85
111.18
1
69.8
124.1
3.94
109.23
2
69.7
115.6
8.41
113.46
3
69.2
44
30.2
93.78
4
67.4
46.2
49
74.58
5
67.2
43.4
95.6
40.8
6
69.4
42.1
113
—
7
73.9
38.9
116
—
8
80.6
37.1
119
—
根据上表,以发酵时间h为横坐标,以pH值(×0.1)、DO值%、干菌体浓度(×0.1)g/L、葡萄糖浓度(×1/6)g/L等为纵坐标,绘制发酵过程中各参数的变化规律的坐标图,观察并分析其变化规律,从而得到发酵过程中大肠杆菌的生长情况和培养基的利用情况。
注:
由于6、7、8号样品中蛋白质含量较多,而葡萄糖较少,用直接滴定法难以滴定,因此6、7、8号样品不予测定和做分析。
下图为发酵过程中各参数的变化规律曲线图:
大肠杆菌经过8个小时的分批发酵培养,发酵过程中pH值(×0.1)、DO值%、干菌体浓度(×0.1)g/L、葡萄糖浓度(×1/6)g/L等参数的变化规律曲线如图所示,可以分为3个阶段:
第一个阶段:
大肠杆菌生长的延迟期是0h到2h。
可以从曲线图看出:
在该阶段内,DO值曲线较原始DO值上升了一点,但幅度不大,基本还是维持在原始DO值的附近值内,葡萄糖浓度曲线和干菌体浓度曲线平缓,无明显变化,即大肠杆菌利用葡萄糖发生发酵的呼吸作用低,说明大肠杆菌还在适应发酵环境。
第二个阶段:
大肠杆菌生长的对数生长期是2h到6h。
可以从曲线图看出:
在2h到3h内,DO值急剧下降,说明大肠杆菌快速生长,需氧量急剧上升,直至3h到6h内,DO值在40%~50%的范围内变化,大肠杆菌代谢能力持续在高水平上,需氧量也相对地维持在高水平范围内;葡萄糖浓度曲线在2h后就急剧下降,大肠杆菌在代谢过程中,利用葡萄糖含量大幅度上升;干菌体浓度曲线在2h到6h内急剧上升,大肠杆菌代谢旺盛,菌体快速生长,细菌很少死亡或不死亡,增长速度呈对数生长。
第三个阶段:
大肠杆菌生长的稳定期是6h后。
可以从曲线图看出:
6h后,菌体浓度曲线趋于平缓,此时生长速率下降,死亡率上升,细胞数达到最大值,新生的细菌数和死亡的细菌数相当;而DO值在30%左右,是由于菌体数达到最大值,仍然需要大量供氧来代谢生长。
由于葡萄糖浓度在6h后极低,合成蛋白质多,在滴点时生成大量气泡,无法测得,故不予讨论。
由于实验发酵时间有限,无法完成整个发酵过程,故不能得到大肠杆菌生长的衰亡期。
总体上看,大肠杆菌的分批发酵培养过程,在限制性条件下的生长,经历了延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。
在发酵过程中,pH值的影响也是不可忽视的。
pH值影响基质水解、酶活性、代谢方向,pH不同,往往引起菌体代谢过程不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。
若不控制pH值,在发酵过程中,葡萄糖的代谢分解成酸和醇,使pH下降,氮的代谢和产物的酸性也会使pH下降,从而影响发酵效果,故应严格控制好pH,该实验中pH控制在7.0。
由pH值曲线图可以看出,在6h前,pH严格控制在7.0左右,菌体正常发酵生长,6h后,pH值开始上升,说明菌体开始自溶,细胞死亡。
温度对发酵的影响:
温度通过影响微生物的酶反应速度、发酵液中溶解氧而影响发酵;温度还能影响酶系组成及酶的特性、以及生物合成方向;温度还影响基质溶解度,氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。
因此对发酵过程中的温度要严格控制,可根据大肠杆菌菌种的生长阶段和培养条件综合考虑,以及发酵大肠杆菌的长期经验考虑,设定该实验发酵大肠杆菌的最适温度是37℃,从表1可以看出,温度已严格控制在最适温度要求范围内。
在发酵过程中,通风和搅拌的剧烈程度影响着泡沫的形成。
通风和搅拌程度小,会使发酵液的溶氧量下降,影响后续发酵,通风和搅拌程度大,则易生成泡沫,而增加染菌的机会,使菌体提早自溶,导致菌体产量下降,故应严格控制通风和搅拌的程度,该实验中,通风量是2~3L/min,搅拌器的转速是303r/min。
综合分析,在发酵过程中,应严格控制pH值、温度、DO值、通风量、搅拌转速等发酵条件,从而发挥菌种的最大生产潜力,得到最大的比生产速率和最大的生产率。
2.1.3最大比生长速率和平均细胞得率系数
⑴分批培养是一种非恒态的培养法,分批培养中细胞的生长动力学:
X—干菌体浓度(g/L)
t—发酵时间(h)
μ—比生长速率(h-1),即单位重量菌体的瞬时增量g/(g·h)
在对数生长阶段,细胞的生长不受限制,因此比生长速率达到最大值μm:
→
→
→
干菌体浓度X与lnX的关系:
时间/h
0
1
2
3
4
5
6
7
8
X
0.185
0.394
0.841
3.02
1.90
9.56
11.3
11.6
11.9
lnX
-1.69
-0.931
-0.173
1.11
1.59
2.26
2.42
2.45
2.48
由于比生长速率达到最大值是在对数生长期内,故取2h到6h这阶段的时间与lnX的关系直线图,如下图:
根据上图,取中间值3h和5h,得:
→
→
=0.36h-1
即大肠杆菌的最大比生长速率为0.36h-1。
⑵细胞得率系数,即菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率,用YX/S表示:
YX/S—相对于基质消耗的实际生长得率(g/mol或g/g)
ΔX—干细胞的生长量(g)
ΔS—基质的消耗量(mol或g)
由于6、7、8h的葡萄糖含量测定不到,故只能计算0h到5h内的细胞得率系数:
即大肠杆菌的平均细胞得率系数为0.799。
2.1.4注意事项
⑴由于分光光度计灵敏度有限,所以应控制OD值在1.000范围内,预测得3h时的发酵液OD值超过1.000,所以稀释5倍,依次类推得其他时间的稀释倍数。
⑵由于每隔1h取样,所以分光光度计应该在前一次测定完后关闭,防止过热,影响后续OD值的测定。
3.参考文献
[1]仓基勇,于会贤,徐岩.小型全震动发酵罐的使用与维护.河北工业科技.2006,03:
2(23).
[2]郭功兵,张天伍,黄道颖.小型生物发酵控制系统的设计.郑州轻工业学院学报(自然科学版).2009,12:
6(24).
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- 小型 发酵 使用 过程 主要 生化 指标 测定