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精华华西药学院药分方法学验证论文

紫外分光光度法测定维生素B1片

含量以及方法验证研究报告

四川大学华西药学院

周鹏翔

2012141661009

2015年5月10日

紫外分光光度法测定维生素B1片含量以及方法验证

周鹏翔

（四川大学华西药学院成都610000）

摘要：

目的：

采用紫外分光光度法测定维生素B1片中维生素B1的含量并对该方法进行验证。

方法：

用紫外-可见分光光度法在246nm处测定吸光度，并用百分吸收系数法、对照品比较法和工作曲线法计算含量；用5个梯度浓度的维生素B1验证线性和范围，用回收率表示准确度，用空白辅料溶液验证专属性。

结果：

在本实验条件下，用紫外分光光度法测定维生素B1含量的方法专属性不高；当维生素B1浓度在7.5μg/ml至17.5μg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程为：

y=0.0387x-0.0013，R2=0.9993；平均回收率为97.49%，RSD（%）为0.79%；吸收系数法测得平均标示量为89.28%（n=3）（RSD为1.35%）；对照品比较法和工作曲线法测得平均标示量分别为97.08%（n=3）（RSD为1.35%）和97.39%（n=3）（RSD为1.34%）。

结论：

本实验条件下，用紫外分光光度法测定维生素B1片中维生素B1的含量操作简便、快速、准确。

实验专属性和准确度不高，线性良好，吸收系数法测定结果不符合ChP（2005版）要求，对照品比较法和工作曲线法符合ChP（2005版）要求。

关键词：

紫外分光光度法维生素B1含量测定方法学验证

维生素B1（VitaminB1）又称硫胺素或抗神经炎素,为白色结晶或结晶性粉末,主要由嘧啶环和噻唑环结合而成。

在酸性溶液中很稳定,在碱性溶液中易被氧化,使分解变质。

故应置于遮光、凉处保存,且不宜久贮,具有保护神经系统的作用[1]。

近年来对维生素Ｂ１测定方法的报道较多，如高效液相色谱法、流动注射化学发光法、多元线性分光光度法、荧光分光光度法、毛细管电泳电化学法、氧瓶燃烧电位滴定法等。

这些方法操作麻烦、时间较长[2]。

紫外分光光度法仪器较便宜，普及度高且方法的操作较简便，故本实验以《现代药学实验教程》中药物分析实验十九为基础，选用紫外分光光度法测定维生素Ｂ１含量并对该测定方法进行验证。

1仪器与试药

实验仪器：

UV-2102c型紫外可见分光光度仪（编号：

20038954）、BP210S电子天平、100ml容量瓶、干燥锥形瓶、干燥漏斗、5ml移液管、10ml滴定管、烧杯、滤纸、胶头滴管、石英比色皿。

实验试药：

维生素B1片（规格10mg×100片，生产批号20110734，国药准字H42020611，华中药业股份有限公司）、盐酸溶液（9→1000）、维生素B1空白辅料、维生素B1储备液0.2500mg/ml、维生素B1储备液0.5000mg/ml、蒸馏水。

2实验原理

测定维生素B1片含量的传统方法有紫外可见分光光度计、HPLC法、分光光度法等。

ChP2010收载有维生素B1及其片剂和注射液。

维生素B1是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵类化合物，噻唑环上季铵及嘧啶环上氨基，为两个碱性基团，可与酸成盐。

维生素B1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收峰，并且维生素B1的紫外吸收峰随溶液pH的变化而不同，pH=2（0.1mol/L）时，最大吸收波长在246nm处，吸收系数为421，根据其最大吸收波长处的吸光度，则可以计算维生素B1含量。

ChP2010收载的维生素B1片剂和注射液均采用本法测定。

维生素B1（又称硫酸硫胺），化学名称为：

氯化4-甲基-3[（2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基）甲基]-5-（2-羟基乙基0噻唑鎓盐酸盐。

结构式如下：

3方法与结果

3.1处方分析

由处方分析可知，主药维生素B1含16.39%，辅料含83.61%，规格为10mg×100片。

若精密称取相当于维生素B125mg的片粉，则取10片维生素B1片，测得总重为0.6155g，平均片重为0.06155g，故待测样品需称重0.1539g，处方成分见表1。

表1维生素B1处方表

成分

含量（g）

比例（%）

维生素B1

10

16.39

淀粉

20

32.78

糊精

30

49.18

硬脂酸镁

1

1.639

3.2测定波长的选择及比色皿配对

维生素B1在pH7时的吸收光谱上有两个吸收峰：

232-233nm、266nm；在pH时吸收峰为246nm。

维生素B1在246nm的吸收峰干扰因素较少，吸收又最强，《中国药典》（2005年版）规定以246nm处吸收峰的百分吸收系数（421）为计算含量依据[3]。

本实验采用于246nm±2nm（即244nm、245nm、246nm、247nm、248nm）波长分别测定某一待测溶液的吸光度，所测结果表示246nm、247nm及248nm的吸光度均为0.288，为遵循中国药典相关规定，故采用246nm波长测定吸光度，见表2。

选取两石英比色皿进行配对，在相同环境下于246nm处测定吸光度，两比色皿吸光度差值A差为0.003，符合吸光度差值不得大于0.005的要求，故选用此对石英比色皿。

表2最大吸收波长测定结果

测定编号

1

2

3

4

5

测定波长（nm）

244

245

246

247

248

吸光度A

0.285

0.287

0.288

0.288

0.288

3.3线性与范围的方法学验证

线性系指测试结果（响应值）与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度，是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如含量测定和杂质定量检查均需要验证线性；而范围系指能达到一定精密度、准确度和线性、测试方法使用的高低限浓度或量的区间[4]。

分别精密量取维生素B1储备液（0.2500mg/ml）3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml、7.00ml至100ml量瓶中，分别加盐酸溶液（9→1000）定容，得相应梯度浓度的对照品液，以盐酸溶液（9→1000）为空白校正，于246nm处测得吸光度A，用Excel2003处理数据，以浓度对吸光度作线性回归，得回归方程，并根据回归方程得到线性良好的回归区间，即维生素B1浓度在7.5μg/ml至17.5μg/ml范围内线性关系良好，详见表3和图1。

表3线性与范围验证结果

测定编号

1

2

3

4

5

对照液体积（ml）

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

浓度（μg/ml）

7.5

10．0

12.5

15.0

17.5

吸光度A

0.291

0.380

0.484

0.583

0.673

回归方程

y=0.0387x-0.0013

R2

0.9993

3.4回收率试验

回收率（%）用来表示准确度，系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

分别精密量取5.0000mg/ml维生素B1储备液4.00ml、5.00ml、6.00ml于100ml量瓶中，分别加入0.127g维生素B1空白辅料，加入适量盐酸溶液（9→1000），充分振摇后用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度。

混匀后过滤，精密量取续滤液5ml与100量瓶中，用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，得到浓度分别为10.0μg/ml、12.5μg/ml、15.0μg/ml的标准溶液，以盐酸溶液（9→1000）为空白校正，于246nm处测定吸光度A，以单点对照法（对照溶液为线性试验中浓度为12.5μg/ml、吸光度A为0.484）计算回收率及其RSD（%），结果记录与表4。

回收率应在98%~102%之间（RSD≤2%）,实际计算得平均回收率为97.49%，未在规定范围内，RSD（%）为0.79%，在规定范围内。

表4回收率验证结果

测定编号

1

2

3

对照液体积（ml）

4

5

6

浓度（μg/ml）

10

12.5

15

加入辅料质量（g）

0.127

0.127

0.127

吸光度A1

0.375

0.475

0.565

吸光度A2

0.375

0.476

0.565

吸光度A3

0.375

0.476

0.565

平均吸光度A

0.375

0.476

0.565

测定浓度（μg/ml）

9.68

12.29

14.59

回收率（%）

96.85

98.35

97.28

平均回收率（%）

97.49

RSD（%）

0.79

3.5专属性试验

专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定被测物的特征。

精密称取辅料0.1273g于1000ml容量瓶中，加入适量盐酸溶液（9→1000）充分振摇,加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀后用干燥滤纸和漏斗过滤。

精密量取续滤液5ml于100ml容量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度作为空白辅料溶液，以盐酸溶液（9→1000）为空白校正，于246nm处测定吸光度A，测得结果为0.009，大于0.005的限定值，表明所使用的紫外可见分光光度仪对本方法的专属性较差，或空白辅料在246nm处有微弱吸收，具体见讨论。

3.6含量测定

取供试品10片，精密称定为为0.6155g，平均片重为0.06155g，分别称取相当于维生素B125mg的片粉0.1536g、0.1538g、0.1535g，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）适量，振摇15min使维生素B1溶解，再加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸过滤，精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000），摇匀，以盐酸溶液（9→1000）为空白校正，于246nm处测定吸光度A，按维生素B1的吸收系数（E

）为421计算，并计算RSD（%）,即得，平均标示量为89.28%，RSD（%）为1.35%。

见表5。

表5维生素B1片样品含量测定结果（吸收系数法）

测定编号

1

2

3

维生素B1片样品质量（g）

0.1536

0.1538

0.1535

吸光度A

0.473

0.463

0.476

标示量（%）

89.71

87.92

90.22

平均标示量（%）

89.28

SD

0.0121

RSD（%）

1.35

将上述所得吸光度结果用对照品比较法（对照品溶液为线性试验中浓度为12.5μg/ml、吸光度A为0.484）进行含量计算，平均标示量为97.08%，RSD（%）为1.35%,见表6。

表6维生素B1片样品含量测定结果（对照品比较法）

测定编号

1

2

3

维生素B1片样品质量（g）

0.1536

0.1538

0.1535

吸光度A

0.473

0.463

0.476

测得浓度（μg/ml）

12.22

11.96

12.29

标示量（%）

97.54

95.6

98.09

平均标示量（%）

97.08

SD

0.0131

RSD（%）

1.35

将上述所得吸光度结果用工作曲线法（由线性与范围试验中得标准曲线：

y=0.0387x-0.0013，R2=0.9993）进行含量计算，平均标示量为97.39%，RSD（%）为1.34%，见表7。

表7维生素B1片样品含量测定结果（工作曲线法）

测定编号

1

2

3

维生素B1片样品质量（g）

0.1536

0.1538

0.1535

吸光度A

0.473

0.463

0.476

测得浓度（ug/ml）

12.26

12.00

12.33

工作曲线方程

y=0.0387x-0.0013

标示量（%）

97.86

95.92

98.41

平均标示量（%）

97.39

SD

0.0131

RSD（%）

1.34

4结论

本实验测定维生素B1样品含量及方法学验证，根据《中国药典》（2005版）关于维生素B1的相关规定，做出如下结论。

线性与范围试验表明该维生素B1样品浓度在7.5μg/ml至17.5μg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程为：

y=0.0387x-0.0013，R2=0.9993（＞0.999），符合要求；回收率试验所得回收率为97.49%，未在98%~102%的规定范围内，RSD（%）为0.79%（≤2%），说明试验准确度较差；专属性测得空白辅料吸光度为0.009（＞0.005）,说明使用的紫外分光光度仪的专属性不高，或空白辅料对测定结果有微弱影响。

样品含量测定中吸收系数法测得平均标示量为89.28%（n=3）（RSD为1.35%），不符合ChP2005中维生素B1片项下维生素B1片含量规定（90.0%~110.0%），为不合格品；样品含量测定对照品比较法和工作曲线法测得平均标示量分别为97.08%（n=3）（RSD为1.35%）和97.39%（n=3）（RSD为1.34%），符合ChP2005中维生素B1片项下维生素B1片含量规定（90.0%~110.0%），故为合格品。

5小结与讨论

本次实验采用紫外-可见分光光度法测量维生素B1片含量并进行方法学验证。

紫外-可见分光光度法是光谱分析法的一种，是通过测定被测物在光谱的特征波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性或定量的分析方法，含量测定方法有对照品比较法、吸收系数法、计算分光光度法和比色法。

而方法学验证包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性，由于实验室条件和时间限制，本次实验仅验证准确度、专属性、线性和范围。

含量测定中采用的三种方法，吸收系数法的标示量为89.28%，未符合ChP的相关要求，而对照品比较法和工作曲线法测得的标示量分别为97.08%和97.39%，均符合ChP的要求，三个方法的RSD（%）相差不大。

可能的原因是，吸收系数法的测定结果受仪器和操作的影响较大，需要注意仪器的校正和检定，但由于实验室限制，我组使用紫外-可见分光光度仪并未校正准确，故误差较大；而对照品比较法由于供试品与对照品在相同环境下测得，故系统误差较低，从而准确度较高；工作曲线法也是在同环境下测得，且所得工作曲线线性较好，故系统误差较低，准确度较高。

方法学验证中，线性和范围项的结果令人满意，回归系数0.9993，线性较好。

但专属性试验中测得A为0.009，考虑为两方面的原因：

所使用的仪器的误差以及空白辅料自身问题，由于另一组也与我组同时在使用同一个仪器，经询问得知他组的专属性也未符合要求，另外，经询问得知同样的空白辅料溶液在其他分光光度仪中的吸光度大多符合要求，且所有组使用的比色皿均符合选用标准，综上所述，本组认为专属性不高的主要原因是仪器所导致的，应将仪器进行校正或改用其他专属性较高的仪器测定。

回收率为97.49%，未在98%~102%的规定范围内，可能的原因有应至少用9个测定结果进行评价，但是由于实验限制，仅采用3个浓度分别读3次数进行回收率试验，使准确度不高。

另外，除了仪器本身和实验限制外，本组成员操作的不规范、天平的称定误差、读数的误差、计算中的误差等都可以影响结果的准确性。

故应明确测定原理、练习规范操作并熟悉正确的计算修约方法。

另外，应重视仪器性能对测定结果的影响，尽量使用精度高、性能先进的仪器，加强对仪器的校正和检定，减少不确定度的来源，另一方面要注意尽量避免小容量液体积的量取和定容，以减小引入的相对不确定度[5]。

再者，维生素B1结构典型，除了本实验用到的方法外，分子中含有硫、氮、氯杂原子，分子中的硫在共轭环内。

故可用氧瓶燃烧法前处理后测定氮元素或者硫元素；回滴法或电位滴定法测样品中氯元素；高效液相色谱法精确分离后再用紫外分光光度法测定各组分的含量[6]。

维生素B1片剂辅料为淀粉、糊精、硬脂酸镁等,其中淀粉、糊精是常用的稀释剂,硬脂酸镁是片剂常用的润滑剂。

在维生素B1含量测定中,硬脂酸镁的干扰作用可分为两个方面:

一方面Mg2+可干扰配位滴定,另一方面硬脂酸根离子能被高氯酸滴定,因而可干扰非水滴定法。

而本实验采用紫外分光光度法测定维生素B1的含量,避免了硬脂酸镁的干扰[7]。

根据所查阅文献，结合实验结果，可以认为用紫外-可见分光光度法进行维生素B1片含量测定操作方便快捷、准确度和灵敏度较高。

参考文献

[1]李莎.HPLC测定谷维素双维B片中维生素B1和维生素B6的含量[J].中国生化药物杂志.2010,31（3）:

176-178.

[2]高雅杰.维生素B1片含量测定方法的验证[J].按摩与康复医学.2010，24（8）:

1-2.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2005年版）[M].化学工业出版社2005:

784.

[4]杭太俊.药物分析.第七版.北京：

人民卫生出版社，2014:

168.

[5]李会轻，庞靖.紫外-可见分光光度法测定维生素B1片含量的不确定度分析[J].齐鲁药事，2009,28（5）：

276-277.

[6]高青.紫外分光光度法测定维生素B1片含量以及方法验证[J].中国医药指南.2012,20（10）:

455-477.

[7]郭亚东,马银海,李燕华.维生素B1、B2含量测定方法比较[J].食品科学,2004,25（6）:

153-156.