蛋白质讲课3.docx
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蛋白质讲课3
第四节蛋白质的结构与功能
围绕一级结构与功能
蛋白质的构象与功能的关系
一、蛋白质的一级结构决定其高级结构
核糖核酸酶(RNase)124氨基酸残基
近似于球形分子
构象的稳定:
氢键等非共价键外,4个二硫键
C.Anfinsen以核糖核酸酶为对象
二硫键的还原和重新氧化对该酶活性的影响
8mol/L尿素和巯基乙醇
二硫键全部还原
酶的三维结构破坏
肽链完全伸展
酶的催化活性完全丧失
透析方法除去变性剂和巯基乙醇后
酶的大部分活性恢复
说明:
完全伸展的多肽链能自动折叠成其活性形式
还原后的核糖核酸酶8mol/L尿素
核糖核酸酶只有1%的活性
因为巯基没有正确的配对
变性核糖核酸酶8个巯基相互配对
几率是随机的,但只有一种是正确的
那些不正确配对的产物称为“错乱”的核糖核酸酶
向“错乱”核糖核酸酶
加入微量的巯基乙醇
10个小时后
“错乱”核糖核酸酶转变为天然的、有全部酶活性的核糖核酸酶
结论:
a蛋白质的变性是可逆的
b变性蛋白在一定的条件下之所以能自动折叠成天然的构象
蛋白质分子多肽链的氨基酸排列顺序包含了自动形成正确的空间构象所需要的全部信息
即一级结构决定其高级结构
二、蛋白质的一级结构与功能
蛋白质的生物学功能根本上决定于它的一级结构
蛋白质分子的进化
蛋白质分子异常而导致的分子病
1.同功能蛋白质氨基酸顺序的种属差异与生物进化
同功能蛋白质(同源蛋白质):
有些蛋白质存在于不同的生物体内,但具有相同的生物学功能
不同种属的同一种蛋白质,其一级结构上有些变化,这就是所谓的种属差异
比较生物化学的角度来研究同功能蛋白质的结构在种属之间的差异,有助于对分子进化的研究
根据它们在结构上的差异程度,可以判断它们之间的亲缘关系
同源蛋白质,有许多位置的氨基酸对所有的种属来说都是相同的,这些称为不变残基
其他位置的氨基酸,对不同种属来说差异较大,这些称为可变残基
同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性被称为顺序同源现象
说明不同种属的生物中具有同一功能的蛋白质,在进化上可来自相同的祖先,但存在着种属差异
在长期的进化过程中不断分化出结构与功能相适应的蛋白质
细胞色素C
脊椎动物104个氨基酸残基
昆虫108个氨基酸残基
植物114个氨基酸残基
其N—端均为乙酰化
对包括脊椎动物、某些无脊椎动物、酵母、较高等的植物等120多个生物种属的细胞色素C的一级结构分析发现,只有28个位置上的氨基酸残基是不变残基
这些多是维持其构象所必须的残基
其他残基可随着进化而变异
亲缘关系愈接近,其氨基酸组成的差异愈小
亲缘关系愈远,氨基酸组成的差异愈大
2.一级结构相同的蛋白质功能也相同
蛋白质的一级结构差异愈小功能的相似性愈大
促肾上腺皮质激素(ACTH)
促黑激素(α-MSH)
N-端13个氨基酸残基完全相同
α-MSHN-端为乙酰化的丝氨酸
Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(α-MSH)
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(ACTH)
将ACTH分子从C-端逐渐切
剩下N-端的13个氨基酸
则ACTH的活性完全消失
而具有显著的α-MSH的活性
3.一级结构上的细微变化可直接影响其功能
L.Pauling分子病
分子病:
由于遗传基因的突变导致了蛋白质分子结构的改变或某种蛋白质的缺乏所引起的疾病
胰岛素分子病
胰岛素分子B链第24位的苯丙氨酸被亮氨酸取代,使胰岛素成为活性很低的分子
1949年LinusPauling及其同事
正常人的血红蛋白(HbA)
镰刀型红细胞贫血症患者的血红蛋白(HbS)
两种血红蛋白分子中所含的可解离基团的种类和数目不同
1954年Vernonlngram指纹图谱分析法
确定了两种血红蛋白分子一级结构上的差异
(HbA)Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-----
(HbS)Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-----
(β链)12345678-------
在HbS分子中多了一个非极性的氨基酸
由于β链上的这个氨基酸处于分子的表面
从而引起脱氧血红蛋白的溶解度下降
在细胞内易聚集沉淀,丧失了结合氧的能力
使正常的红细胞变为长而薄,呈新月状或镰刀状
1988美国国立癌症研究所Barbacid
麻省理工学院Weinberg
膀胱癌细胞P21蛋白(Mr=21000)
与正常细胞中的这一蛋白相比
也仅仅是一个氨基酸的差异
第12位Gly被Val取代
三、蛋白质的空间结构与功能
生物体内各种蛋白质都具有特定的构象
而这种构象是与它们各自的功能相适应的
1.胰岛素的结构与功能
胰岛素有A、B两条肽链组成
A链中没有典型的α-螺旋结构
B链中有螺旋结构和β-转角结构
还有β-折叠结构
胰岛素分子内部有一疏水的核心
极性侧链都位于分子的表面
不同来源的胰岛素尽管氨基酸组成有差别,但功能相同,这是由于分子中6个半胱氨酸的位置不变
说明:
不同来源的胰岛素具有相同的连接方式
三对二硫键使不同来源的胰岛素具有相同的空间构象
2.血红蛋白的结构与功能
人、昆虫豆血红蛋白
一级结构相似性小于20%
但它们的构象十分相似
与血红素相连的氨基酸都是组氨酸和苯丙氨酸
它们使血红素正确定位
(1)血红蛋白与氧的结合具协同性
血红蛋白两条α链两条β链
血红蛋白α链和β链(尤其是β链)与肌红蛋白的构象十分相似
它们所含氨基酸的种类、数目和其排列顺序都有较大的差异,但它们的三级结构十分相似
由于结构相似,它们都具有基本的氧合功能
但血红蛋白是四聚体,分子结构复杂得多
有肌红蛋白所没有的功能如运输质子、二氧化碳
在溶液中,血红蛋白分子上已结合氧的位置数与可能结合氧的位置数之比称为饱和度(饱和分数)
血红蛋白S型
肌红蛋白双曲线
通常用P50来表示某一分子和氧的亲和力
指50%的氧结合部位被占据时所对应的氧分压
肌红蛋白的P50=1Torr
血红蛋白的P50=26Torr
S型曲线说明血红蛋白与氧的结合具有协同性
脱氧血红蛋白分子的四条多肽链的C端都参与了盐桥的形成
盐桥的存在使它处于受约束的强制状态
但当一个氧分子冲破了某种阻力和血红蛋白的一个亚基结合后,这些盐桥被打断,使得亚基的构象发生改变
引起邻近亚基的构象也发生改变更易于和氧的结合,并继续影响第三个、第四个亚基与氧的结合
故表现出S型的氧合曲线
此现象Monod发现
提出了蛋白质的变构作用
血红蛋白和肌红蛋白结合氧的能力依赖于分子中的血红素辅基
血红蛋白的每一条肽链都含有一个血红素辅基
血红素由原卟啉IX和一个铁离子Fe2+组成
作为亚铁离子可形成6个配位键
其中4个与原卟啉环中央的四个氮原子连接
剩下两个结合价,可以在卟啉环的两侧继续结合
一个与近位His93(F8)残基结合,同时第六个位置可与氧可逆结合
非氧合状态时该位置由水分子占有
血红蛋白分子中的四个血红素是埋在贴近分子表面的袋穴中,周围是一个疏水的环境
血红素中的铁原子可以是二价的亚铁血红蛋白
也可以是三价的正铁血红蛋白
只有亚铁血红蛋白才能与氧结合
铁原子因电子所占外层轨道的不同,有高自旋和低自旋两种形式
铁原子在低自旋状态时半径较小,它能进入卟啉环内而位于四个氮原子所形成的平面中央
在氧合前,Fe2+由于它的高自旋状态
近位的组氨酸和卟啉环氮原子间的斥力
使它和邻近的组氨酸都位于卟啉环平面“圆屋顶”距卟啉环平面大约0.04~0.06nm
整个分子由于链间盐桥的存在,处于一种非常紧张的状态,它很难与氧结合
当氧与血红素Fe2+形成第六个配位键时
Fe2+从高自旋状态转变为低自旋状态,半径缩小,从而使铁落入卟啉环内,血红素环也趋于平坦
进而导致其他亚基血红素结合氧功能的改变
成为带动高级结构变化的一个关键的配位体
在一定的条件下,血红蛋白的亚基可解离
分离得到的α链与肌红蛋白的性质十分相似
α链本身与氧的亲和力较高,氧合曲线为双曲线
分离得到的β链易聚合形成四聚体结构(β4)
与氧的亲和力高
但与α链、肌红蛋白一样,β4也没有血红蛋白的变构性质
结论:
血红蛋白的功能单位是由两类多肽链组成的四聚体结构
它的变构性质来自于它的亚基间的相互作用
(2)二磷酸甘油酸(BPG)可降低血红蛋白与氧的亲和力
(3)质子和二氧化碳促进血红蛋白释放氧
3.免疫球蛋白的结构与功能
第五节蛋白质的性质
一、蛋白质的胶体性质
蛋白质分子大小已经达到胶体质点的范围
蛋白质分子表面有许多亲水的基团
每一克蛋白质约可以结合0.3—0.5g的水
水膜的存在,蛋白质颗粒彼此不能接近
增加了蛋白质溶液的稳定性
蛋白质分子表面具有许多可解离的基团
在一定的pH条件下,能与其周围电性相反的离子形成所谓双电层
由于水化层和双电层这两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液
胶体溶液重要的性质不能通过半透膜
半透膜是指膜上具有小孔,只允许水及小分子物质通过,而蛋白质等大分子不能通过
动物体内的各种膜,另外人造火棉胶、羊皮纸、玻璃纸等都是半透膜
生产实践用半透膜作成透析袋
除去蛋白质样品中所混有的小分子物质
二、两性性质和等电点
蛋白质分子末端有游离的-NH2-COOH
表面仍带有许多可解离的基团
如酚羟基、氨基、羧基、咪唑基等
因此蛋白质是两性电解质
既可与酸,又可与碱相互作用
溶液中蛋白质的带电情况与它所处环境的pH有关
调节溶液的pH,可以使一个蛋白质带正电或带负电或不带电
在某一pH时,蛋白质分子中所带的正电荷数目与负电荷数相等,即静电荷为零,在电场中不移动,此时溶液的pH即为该种蛋白质的等电点
不同蛋白质,由于氨基酸组成不同,等电点不同,在同一pH条件下所带净电荷不同,在同一电场中移动的方向、速度不同,因此可以相互分离
在等电状态的蛋白质分子,其物理性质有所改变,但最显著的是溶解度最小
蛋白质的等电点随介质的离子组成、pH而有所变动
测定蛋白质的等电点时,要在一定pH、离子强度的缓冲液中进行
在不含任何盐的纯水中进行蛋白质等电点的测定时,所得到的值称为等离子点(isoionicpoint)
此时,分子的带电情况仅仅取决于分子本身的解离情况
三、蛋白质的变性作用与复性
蛋白质的变性作用:
蛋白质因受某些物理的或化学的因素的影响,分子的空间构象破坏,从而导致其理化性质,生物学活性改变的现象。
强酸、强碱、剧烈搅拌、重金属盐类、有机溶剂、脲、胍类、超声波等都可使蛋白质变性
用现代蛋白质化学的术语来说
蛋白质的变性就是二级结构以上的高级结构的破坏,而导致生物活性丧失的过程
变性蛋白因疏水基团外露,溶解度降低,分子的不对称性增加,尤其是球蛋白
变性蛋白失去结晶能力,易被蛋白酶水解
蛋白质的复性(renaturation):
某些蛋白质变性后可以在一定的实验条件下恢复原来的空间构象,使生物学活性恢复。
变性蛋白能否复性,这一问题至今仍有疑问
被大多数人接受的观点是:
蛋白质变性的可逆性与导致变性的因素、蛋白质的种类以及蛋白质分子结构改变的程度都有关系
如胰蛋白酶在酸性条件下短时间加热可使其变性,但缓慢地冷却,胰蛋白酶可以复性
血红蛋白在酸性条件下易变性,但如果用碱缓慢中和,可使其活性部分恢复
四、蛋白质的沉淀作用
如果向蛋白质溶液中加入某种电解质,以破坏其颗粒表面的双电层或调节溶液的pH,使其达到等电点,蛋白质颗粒因失去电荷变得不稳定而将沉淀析出
蛋白质的沉淀作用:
由于受到某些因素的影响蛋白质从溶液中析出的作用
可逆的不可逆两种类型
1.可逆的沉淀作用
蛋白质发生沉淀后,若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后,可使蛋白质恢复原来的溶解状态
若用透析除去盐类,蛋白质可重新溶解于原来的溶剂中,这种沉淀作用称为可逆的沉淀作用
如果向蛋白质溶液中加入大量的盐类,如硫酸铵,蛋白质的溶解度逐渐下降,以致从溶液中沉淀出来,这称为盐析作用
在稀盐溶液中,大多数蛋白质的溶解度增加,这种现象称为盐溶作用
不同的蛋白质由于氨基酸组成不同,结构不同,从溶液中析出所需要的盐的浓度不同
向含有多种蛋白质的溶液中加入不同浓度的盐,使不同的蛋白质依次从溶液中沉淀出来的方法称为分级盐析
因为盐类既是电解质,又是脱水剂,使蛋白质失去电荷,脱去水化层而沉淀
硫酸铵常用的沉淀蛋白质的盐类,溶解度大
2.不可逆的沉淀作用
如重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等都可使蛋白质发生沉淀,且不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中,这种沉淀作用称为不可逆的沉淀作用
(1)重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下蛋白质带负电,可与重金属离子如汞离子、铅离子结合,形成不溶性的重金属蛋白沉淀
临床上,常用醋酸铅或硫酸铜沉淀体液中的蛋白质,以分析体液中的氨基酸或其他小分子化合物
长期从事重金属作业的人,应吃高蛋白食物
(2)生物碱试剂沉淀蛋白质
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质
生物碱试剂:
能够沉淀生物碱的试剂
单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等都能沉淀生物碱
在酸性条件下蛋白质带正电荷
与生物碱试剂如三氯乙酸的酸根离子结合
空腹吃了大量的柿子单宁酸
肠胃中的蛋白质凝固变性“柿石症”
(3)有机溶剂的沉淀作用
能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等
破坏水化层,降低溶液的介电常数
使蛋白质分子之间的静电作用增加而易于聚集沉淀
五、蛋白质的沉降作用
溶液中的蛋白质强大的离心力
如果蛋白质溶液的密度大于溶剂的密度,蛋白质分子就会下沉
沉降的速度与蛋白质分子的大小和密度有关,也与蛋白质的分子形状、溶剂的密度和粘度有关
沉降速度每单位时间内颗粒下沉的距离表示
在离心场中,蛋白质分子所受到的净离心力(离心力减去浮力)与溶剂的摩擦阻力平衡时
每单位离心场强度的沉降速度为定值
沉降系数(SedimentationCoefficient):
即每单位引力场中沉降分子下沉的速度
蛋白质的沉降系数常用S20.w表示,温度校正为20C,溶剂为水
超离心法创始人瑞典白质化学家T.Svedberg
国际上采用了Svedberg沉降系数的单位
蛋白质、核酸沉降系数1~200×10-13s
蛋白质浓度为零沉降系数近于1×10-13s
把10-13s为一个漂浮单位或一个Svedberg单位
或直接称为一个S
如一个蛋白质沉降系数为8×10-13s为8S
沉降系数
随着相对分子质量的增加而增加
但它们之间并无正比关系
还受到蛋白质分子的摩擦系数(即分子形状)的影响有关分子形状的参数扩散系数
大分子沉降得快而扩散得慢
分子量愈大沉降愈快
沉降分析不仅可以提供关于分子量的数据
也可以作为鉴定蛋白质分子均一性的一种方法
第六节蛋白质的分离纯化和测定
一、蛋白质分离纯化的一般原则
许多蛋白质是重要的药物
研究蛋白质的结构与功能的关系,制备一些特殊功能的蛋白质,也需要获得一定量的纯品作为研究的对象
生物技术所需的许多工具酶,如DNA连接酶、限制性核酸内切酶等本身就是蛋白质。
一项复杂的工作:
大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等结合在一起
许多蛋白质在性质、结构上有许多相似之处
到目前为止,还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来
但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品
且分离工作中的关键步骤、基本手段还是共同的
蛋白质分离纯化的基本原则有以下几点:
1.材料的预处理及细胞破碎
所用的材料必须新鲜,含量高
如果要制备的蛋白质对丙酮不敏感,可将材料先用丙酮处理成干燥状态,以防止组织中的蛋白酶对蛋白质的破坏作用,并确保蛋白质不至于因温度的变化而变性
除体液外,一般材料都需要破碎,以使蛋白质从细胞中释放出来
以下为常用的破坏组织细胞的方法
1机械破碎法利用机械力的搅切作用,使细胞破碎
高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等
2渗透破碎法利用低渗条件细胞溶胀而破碎
3反复冻融法组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破,
该法简单方便,对温度变化敏感的蛋白质不宜
4超声波法超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均
而使细胞破碎
⑤酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等
2.蛋白质的抽提
抽提是根据所要制备的蛋白质的性质,选择合适的溶剂将蛋白质与其他杂质分开
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择,应根据欲制备的蛋白质的性质而定
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX—100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性
3.蛋白质粗制品的获得
有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离
常用的有下列几种方法:
1等电点沉淀法
不同蛋白质、氨基酸组成不同,等电点不同
可用等电点沉淀法使它们相互分离
蛋白质溶液中的盐浓度要尽量低
因为盐的存在,会使蛋白质的等电点有所改变,盐类本身也影响蛋白质的溶解行为
2盐析法
由于不同蛋白质对中性盐浓度变化的反应不同,盐析法就成为分离蛋白质混合物的一个重要步骤
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质
磷酸钾和硫酸钠的盐析效果最好,但溶解度低,且受温度的影响较大
硫酸铵由于在水中的溶解度最大,受温度的影响较小,常用于盐析法沉淀蛋白质
3有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮,可与水混溶,它们的介电常数比水低
若向蛋白质混合溶液中加入这些溶剂,会增加相反电荷之间的吸引力,并能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质
在某一蛋白质的等电点附近,蛋白质分子主要以偶极离子形式存在,此时再加入乙醇或丙酮,增加了偶极离子间的静电吸引,从而使蛋白质分子相互聚集而沉淀出来,效果更好
此外,有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水化层,也促使蛋白质分子变的不稳定而析出
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度
二、分离纯化的主要方法
常用的纯化方法有:
离子交换纤维素色谱、分子排阻色谱、亲和色谱、疏水色谱等等
有时还需要这几种方法的联合使用
在联合使用这些技术时,孰先孰后,应根据具体的分离对象而定,没有统一的标准
1.凝胶过滤法(gel-filtrationchromatography)
又称为分子排阻色谱,分子筛色谱
使用葡聚糖凝胶,即交联葡聚糖,商品名为Sephadex
由水溶性的葡聚糖(Dextran)和环氧氯丙烷交联而成
具有网状结构,其交联度或网孔大小决定了凝胶的分级范围
当把这种凝胶装入一根细的玻璃管中
使不同蛋白质的混合溶液从柱顶流下
由于网孔大小的影响,对不同大小的蛋白质分子将产生不同的排阻现象
比网孔大的蛋白质分子不能进入网孔内而被排阻在凝胶颗粒周围,先随着溶液往下流动
比网孔小的蛋白质分子可进入网孔内
由于不同的蛋白质分子大小不同,进入网孔的程度不同,因此流出的速度不同,从而达到分离目的
2.纤维素柱色谱法
利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础
人工合成的纤维素衍生物具松散的亲水性网状结构,
有较大的表面积蛋白质大分子可以自由通过
因此常用于蛋白质的分离
(1)甲基纤维素(CM-纤维素)
在纤维素颗粒上带有羧甲基基团
在中性pH条件下,羧甲基上的质子可解离下来,而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素结合
这是一种阳离子交换纤维素
蛋白质与离子交换纤维素之间的结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间的静电吸引
(2)二乙氨基乙基纤维素(DEAE—纤维素)
在中性pH条件下,它含有带正电荷的基团
可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合
它是一种阴离子交换纤维素
当蛋白质混合溶液通过装有时,带正电荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来
带负电荷的蛋白质将被结合到柱上
结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引
然后选用一定pH和离子强度的缓冲液进行洗脱
使蛋白质分子所带的静电荷性质改变
依次从柱上流下达到相互分离之目的
3.亲和色谱(affinitychromatosraphy)
根据蛋白质对特定的化学基团具有专一性结合的原理
这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为配基(或配体)
亲和色谱是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法
如酶对它的作用物、底物具有特殊的亲和力,抗原和抗体互为配基
以伴刀豆球蛋白A的分离纯化为例
该蛋白对葡萄糖有专一性亲和吸附
可把葡萄糖通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面上
为了防止载体表面的空间位阻影响待分离的蛋白质大分子与其配基的结合
在配基和载体之间往往插入一段所谓的连接臂(间隔臂)使配体与载体之间保持足够的距离
将这种多糖颗粒装入一定规格的玻璃管中就制成了一根亲和色谱柱
当含有伴刀豆球蛋白的提取液加到这种物质填充的柱的上部,并沿柱向下流过时,待纯化的蛋白质与其特异性配基结合而被吸附到柱上,其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出
然后采用一定的洗脱条件,如浓的葡萄糖溶液进行洗脱,即可把该蛋白质洗脱下来,达到与其他蛋白质分离的目的。
4.高效(压)液相色谱(HPLC)
本法具有快速、灵敏、分辨率高等优点
使用不同支持物作为填料,如葡聚糖凝胶、离子交换纤维素、亲和介质等,可制成不同的高效液相色谱柱,用于氨基酸、多肽和蛋白质的分离纯化
5.疏水色谱
该方法是利用蛋白质的疏水性质,使用疏水凝胶作为分离介质
在高盐浓度下,蛋白质的疏水性增加,可与疏水性介质结合
然后使盐浓度逐次被洗脱下来而达到纯化的目的
三、蛋白质分子量的测定
方法很多常用的方法有以下几种
1.凝胶过滤法
凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据分子量大小
由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围,在此范围内,分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系
用几种已知分子量的蛋白质为标准,进行色谱分析
以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图,绘制出标准洗脱曲线
未知蛋白质在同样的条件下作色谱分析
根据其所用的洗脱体积,从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来
2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量
在外加电场作用下,带电颗粒向着与其所带电荷相反的电极移动的现象,称为电泳
带电颗粒在电场中移动的速度决定于它所带净电荷的多少以及颗粒的大小及形状
不同的蛋白质,氨基酸组成不同,等电点不同,在同一pH条件下所带的净电荷多少不同
因此在同一电场中的迁移速度不同而达到互相分离之目的。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)
用丙烯酰胺为单体,N,N—亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成的具网状结构的凝胶
聚丙烯酰胺凝胶可制成凝胶柱也可制成凝胶板
把凝胶制成相连的两层凝胶,使它们的孔径大小不同,这样的凝胶在分离蛋白质混合物时
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