盐析法制蛋白.docx
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盐析法制蛋白
IgG的分离与提纯:
硫酸铵沉淀法
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2020-08-2316:
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以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个超级复杂的混合物,包括血清的全数成份。
可是同抗原特异性结合的抗体那么主若是血清中的免疫球蛋白组分。
通经常使用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必需高度纯化并具有特异性,不该含有非抗体的血清蛋白。
因此,为了浓缩和提高抗体的效价,或为制备免疫球蛋白特异性抗体时,通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白(IgG)是血清免疫球蛋白的要紧成份,约占全数免疫球蛋白的75%,因此,抗体的分离纯化主若是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话,用proteinA或proteinG就能够够,疏水柱等也能够纯化;大量的话,上百ml,能够利用streamlineproteinA。
之前依照载量估量一下需要的柱子体积。
实验室中经常使用硫酸铵沉淀后过DEAE纤维素柱,比较简即可获较纯的抗体。
下面以此方式为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制
一、动物血清
二、硫酸铵饱和溶液
硫酸铵800g~850g
H2O1000ml
加热至绝大部份溶质溶解为止,趁热过滤,置室温留宿,然后以28%NH4OH调pH至(不调pH值也能够)。
注:
硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有阻碍。
如次品必需除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置留宿后滤过,加热蒸发H2S即可。
3、L液
A液:
LNaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O15.60g
加H2O至
B液:
LNa2HPO4液
Na2HPO4·12H2O35.80g
加H2O至1000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液
五、纳氏液
HgI115.00g
KI80.00g
加H2O至
溶化后过滤,然后再加20%,混合即可。
六、Mol/L的HCl液和Mol/L的NaOH液
7、洗脱液
L的NaCl液。
八、透析袋(或玻璃纸)
二、操作方式
一、取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
二、3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4、3000r/min离心20min,弃上清。
五、于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
六、3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。
重复步骤5,2~3次。
7、用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
八、透析除盐,在常水中透析留宿,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,显现砖红色即以为有NH4存在),直至无SO42-或NH4显现为止。
也可采纳SephadexG25或电透析除盐。
九、离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG(即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10、过DEAE-纤维素层析柱。
以L(LNaCl)洗脱,搜集洗脱液。
也可采纳SephadexG150或G200柱。
1一、蛋白质及其定量鉴定。
1二、IgG的纯度鉴定可采纳以下方式之一鉴定。
(1)区带电泳
玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳都可。
加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位显现一条带。
操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
(2)琼脂双相双扩散鉴定
预先预备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。
将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,那么在两样品孔之间显现一条沉淀线。
(3)免疫电泳鉴定
孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观看结果。
若是提取的IgG纯的话,那么只显现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。
此鉴定必需同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
(4)圆盘电泳鉴定
用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。
全血清样品在圆盘电泳上显现数十条区带,而纯化的IgG那么只有一条区带。
13、IgG的浓缩与保留
(1)IgG的浓缩
(2)IgG的保留
一样浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保留,或加%硫柳汞在一般冰箱或低温冰箱保留,注意避免反复冻融。
四、蛋白质的分离纯化
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的,需进一步纯化。
纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开,将各类不同的蛋白质分开。
选择提取条件时,就要考虑尽可能除去非蛋白质。
一样老是有其它物质伴随混入提取液中。
但有些杂质(如脂肪)以事前除去为宜。
先除去便于以后操作。
经常使用有机溶剂提取除去。
对于异类物质,提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖,一般可用专一性酶水解,有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。
小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。
而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离,情况则复杂得多。
主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。
其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多,有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多,柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。
如前所述,蛋白质的分离纯化较难,而且其本身的性质又限制了某些方法的使用,因此要研究目的物的微细特征,巧妙的联用各种方法并进行严密的操作,同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。
具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。
其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。
如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。
可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。
根据经验即或纯净的标准品,有极微量的不纯物时,也会给实验带来较大的影响。
不稳定的蛋白质,如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等,要确认不含重金属离子(特级试剂也需检定)。
蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子化合物不同,必须经过独特的繁琐操作。
蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。
诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。
蛋白质提取液中,除包括所需要的蛋白质(或酶)外,还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。
除去的方式有:
1)核酸沉淀法
该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。
必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。
即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30~60min,可使DNA降解为足够小的碎片,以致不阻碍以后的纯化。
2)醋酸铅沉淀法
利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。
因这些沉淀剂也常常使需要的酶(或蛋白质)缓缓变性而失去活性,所以用这类试剂时应迅速进行盐析,使样品与这类试剂脱离接触。
3)调pH值或加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。
利用蛋白质的热变性的温度系数差异,可在一定的PH下将蛋白提取液加热到一定的温度,使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。
4)选择性变性法
利用各种蛋白质稳定性的不同,可用选择性变性法来除去杂蛋白。
例如胰蛋白酶及细胞色素C等少数特别稳定的酶,甚至可用%三氯醋酸处理,此时其它杂蛋白均变性而沉淀,而胰蛋白酶和细胞色素C则仍留在溶液中。
5)透析法
小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离,或最后用透析法除去。
一、利用溶解度不同的纯化方式
原理:
盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。
对蛋白质和酶的提纯应用也最早。
至今还广泛使用,一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。
也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。
其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加(盐溶,与离子强度10~1间成比例增加)。
球蛋白当盐浓度不断上升时,蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出(盐析)(离子强度I2~10)。
这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。
当水中加入少量盐时,盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响,使蛋白质在水中溶解度增大。
但盐浓度增加一定程度时,水的活度降低,蛋白质表面的电荷大量被中和,水化膜被破坏,于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。
盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。
盐析时蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系,可用下式表示:
S
1g-----=-ks×l
So
式中S0为蛋白质在纯水(离子强度I=0)中的溶解度,S为蛋白质在溶液的离子强度为I时的溶解度,KS为盐析常数。
离子强度可用下式计算。
:
1
I=---ΣmiZi2
2
式中mi为溶液中各种离子摩尔浓度,Zi为各种离子的价数。
①式中当温度一按时,S0关于某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数,故
(1)式也改定为:
lgS=β-ks×I
式中β=lgS0,也为一常数,β值要紧取决于蛋白质性质,第二与溶液的PH和温度有关。
ks值主要和盐的性质(包括盐离子价数和平均半径)有关,也与蛋白质结构有关。
一般来说,蛋白质在某一盐液中ks愈大,盐析效果愈好。
蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子,常需用要较高的I值才能从溶液中析出。
根据(3)式分离纯化蛋白质,可在一定的PH和温度下改变盐的I值,称为“ks分段盐析法”,提纯前期常应用此法;也可在一定I值下改变PH及温度,称为“β分段盐析法”,常用于提纯后期,特别是使某些蛋白质结晶析出时。
盐的选择:
如上所述,蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目,即取决于蛋白质的水合程度。
因此,控制水合程度,也就是控制蛋白质的溶解度。
控制方法最常用的是加入中性盐。
主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最广的是硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25℃时饱满和溶解度为,即767g/l;0℃时饱满和溶解度为,即676g/l)。
在这一溶解度范围内,许多蛋白质都可盐析出来,且硫酸铵价廉易患,分段成效较其它盐好,不易引发蛋白质变性。
应用硫酸铵时对蛋白氮的测定有干扰,另外缓冲能力较差,故有时也应用硫酸钠,如盐析免疫球蛋白,用硫酸钠的成效也不错,硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。
其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好,但也由于溶解度太低,受温度阻碍大,故应用不广。
氯化钠的溶解度不如硫酸铵,但在不同温度下它的溶解度转变不大,这是方便的地方。
它也是廉价不易纯化的试剂。
硫酸铵浓溶液的PH常在~之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH值往往降至
以下,当用其他PH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.
硫酸铵饱和度计算及加入方式
在分段盐析时,加盐浓度一般以饱和度表示,饱和溶液的饱和度为100%。
用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。
一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时,加入饱和硫酸铵溶液。
配制法是加入过量的硫酸铵,热至50~60℃保温数分钟,趁热滤去沉淀,再生0℃或25℃下平稳1~2天,有固体析出时即达100%饱和度。
盐析所需饱和度
可按下式计算:
S2-S1
V=V0--------------
1-S2
式中V及V0分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积,S2和S1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。
严格来说,混合不同体积的溶液时,总体积会发生变化使上式造成误差,但这
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