2CTAB法植物总DNA提取.docx

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2CTAB法植物总DNA提取

2×CTAB法植物总DNA提取

1.液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。

改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇

研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。

若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。

2.加入500µl的2*CTAB（60℃或65℃预热）,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。

3.取出离心管，加入等体积的24：

1（三氯甲烷：

异戊醇），上下颠倒充分混合。

若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。

4.12000转速离心5-10min。

将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。

a.离心后溶液分三层：

上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿

b.迅速进入下一步，以免各相混合

5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。

a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。

b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：

1，再次抽提一次，直至中间层较薄。

6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。

沉淀至少15分钟至过夜。

6-1在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2,3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。

6-3.在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。

a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多

7.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。

12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。

重复一遍。

8.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。

9.在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。

10.用琼脂糖凝胶检测结果。

11.-20℃——-70℃低温保存。

去除总DNA中的RNA污染先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤

A

1.在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200µl,加入10µRNase-A（10mg/ml）4℃过夜，或者37℃1h.

2.用等体积的24：

1抽提。

3.沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA——溶解DNA——-20℃——-70℃低温保存。

B直接加入10µRNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。

试剂配方

1MTris-HCl（pH7.4,7.6,8.0）

pH

浓HCl

Tris

去离子水

7.4

约70ml

121.1g

定容至1升

7.6

约60ml

121.1g

定容至1升

8.0

约42ml

121.1g

定容至1升

高温高压灭菌后，室温保存

注意：

应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位

5×TBE缓冲液

Tris

硼酸

0.5MEDTA（pH8.0）

去离子水

54g

27.5g

20ml

定容至1L

室温保存

50×TAE缓冲液

Tris

冰乙酸

0.5MEDTA（pH8.0）

去离子水

242g

57.1ml

100ml

定容至1L

室温保存

2×CTAB

成分

终浓度

已有溶液浓度

配100ml所加量

CTAB

2%

2g

Tris-HCl（pH8.0）

100mM

1M

10ml

EDTA

20mM

0.5M

4ml

NaCl

1.4M

5M

28ml

0.5MEDTA（pH8.0）

二水乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA·2H2O

NaOH

去离子水

186.1g

约20克

定容至1L

高温高压灭菌，室温保存。

注：

只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。

溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

耗材准备：

需要灭菌者：

1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、

其他：

卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。

CTAB法提取植物基因组

药品：

2*CTAB

终浓度组分药品用量

0.1M/L1MTris-HCl（pH8.0）100ml

20nM/L0.5MEDTA（pH8.0）40ml

NaCl82g

CTAB20g

PVP4020g

加去离子水800ml充分溶解定容到1L。

120℃1.5个大气压，灭菌20分钟

用之前加0.2-1%的

0.5MEDTA（pH8.0）

配制量：

1L

配制方法：

1.称取186.1gNa2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。

2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3.用NaOH调节pH值值8.0（约20gNaOH）。

注意：

pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

4.加去离子水将溶液定容至1L。

5.适量分成小份后，高温高压灭菌。

6.室温保存

1MTris-HCl（pH8.0）

氯仿：

异戊醇24:

1异丙醇

流程

1、研钵预冷，叶片放入研钵，加液氮，研磨成粉末，用小勺放入2.0mlEP管。

2、加入65℃预热的2*CTAB600ul,摇匀;

3、65℃水浴1小时，10min摇动一次

4、12000rpm离心10min,取上清到一新的EP管中。

（次步骤视情况可省略）

5、加入200ul氯仿：

异戊醇（24:

1）。

6、12000rpm离心10min,取上层水相到一新的EP管中。

7、加入等体积的异丙醇，轻轻上下摇动10次，静置10min。

8、12000rpm离心10min，弃上清

9、加入75%乙醇1.0ml,摇动

10、12000rpm离心2min，弃上清

11、吸取多余乙醇，室温吹干

12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。

-20℃保存

CTAB法提取植物基因组DNA

CTAB法原理

CTAB（Cetyltrimethylammoniumbromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去

在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制：

PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）

巯基乙醇

氯仿︰异戊醇（24︰1）

异丙醇

70%乙醇

Tris-苯酚

RNaseA

无水乙醇

CTAB溶液：

CTAB——20g/L

NaCl（58.44）——1.4mol/L（81.816g）

EDTA（292.25）——10mmol/L（2.9225g）

Tris（121.14）——100mmol/L（12.114g）

pH8.0

1×TE缓冲液：

EDTA（292.25）——1mmol/L（0.29225g）

Tris（121.14）——10mmol/L（1.2114g）

pH8.0

NaAC溶液：

NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）

pH4.0

植物总DNA的提取

1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。

2、将（200ml）CTAB溶液放于65℃水浴锅中预热。

3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。

4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65℃水浴锅中，保温30~60min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。

5、加入3~4ml氯仿︰异戊醇（24︰1）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100~200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。

6、15~20℃，11000rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差<0.03g）。

7、取上清（用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。

），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4℃冰箱过夜）。

8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多）（或4℃，10000rpm离心5min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，放置超净台中吹干。

9、加入2ml1×TE缓冲液溶解，可放入4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃水浴中最低，防止酶降解DNA）。

10、未溶解的，可放入65℃水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。

11、加入2.5ulRNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离心，升至4000rpm即停，使RNaseA和溶液充分混合。

12、37℃水浴，保温1h。

13、加入1mlTris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇（24︰1），摇均配平，4℃，11000rpm离心10min。

14、取上清，加1×TE补至2ml，加2ml氯仿︰异戊醇（24︰1）摇均配平，4℃，11000rpm离心10min。

15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。

16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20℃冰箱），摇均，放入-20℃冰箱沉淀30min。

17、用毛细玻璃管将DNA挑出（或用无水乙醇配平，4℃，10000rpm离心4min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，转入1.5ml离心管，放置超净台中吹干。

18、将DNA溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4℃保存，长期-80℃冰箱中储存。

19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。

并用紫外分光光度计测其浓度。

注解：

1、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：

是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

2、CTAB：

溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

3、NaCl：

提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；

4、EDTA：

螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

5、Tris（pH8.0）：

提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

6、β-巯基乙醇：

是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

7、苯酚：

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：

（1）有效变性蛋白质；

（2）抑制了DNase的降解作用。

缺点：

（1）能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

（2）不能完全抑制RNase的活性。

8、氯仿：

克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：

去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。

9、异戊醇：

减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

基因组DNA提取常见问题：

1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：

重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA。

2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：

让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数（2-3次）

3、DNA中有RNA的存留：

加入RNase降解RNA。

4、材料不新鲜或反复冻融：

尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。

5、未很好抑制内源核酸酶的活性：

在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。

6、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：

细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

7、外源核酸酶污染：

所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

8、反复冻融。

将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：

1、确保采样后立即投入液氮中保存。

2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温，否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候，先将几个离心管放入一个装有液氮的容器内，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。

将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。

Geini关于CTAB法提取基因组DNA，原理

CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：

1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。

缺点：

1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：

克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：

去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：

减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的。

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

发布:

2010-06-0208:

20|来源:

生物吧|编辑:

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原理：

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：

CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方：

Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；

CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方：

（1）PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；

（2）蛋白质的去除：

酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；

（3）多糖的去除：

高盐法：

用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。

用多糖水解酶将多糖降解。

在提取缓冲液中加一定量的氯苯（1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。

用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：

在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000（含1.2MNaCl），冰浴20min.核酸分离，纯化；

（4）多酚的去除:

在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：

β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：

如PVP（聚乙烯吡咯酮）,PEG（聚乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；

（5）盐离子的去除：

70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc（pH5.2,3M），用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题

DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。

DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。

对策：

重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数（2-3次），加入RNase降解RNA。

（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

DNA提取常见问题：

材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。

尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。

在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

（2）DNA降解，DNA提取常见问题。

实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。

尽量选用新鲜（幼嫩）的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。

高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞,细菌可增加PK的用量）。

增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。

要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：

1.确保采样后立即投入液氮中保存.

2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！

否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候，材料一定要有液氮的保护才行！

否则研磨时的液氮保护DNA不都前功尽弃了？

可以这样做：

将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。

将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。

提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必须一直提醒自己，减少材料回温的机会，液氮保护必须自始至终。

3.在用CTAB法提取时，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！

4.加酚/氯仿/异戊醇静置30min后，离心温度不可过低。

尽量保持在15度以上。

5.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。

这点很重要。

过尖的枪头会把DNA链弄断。

6.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出，尽量不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多了。

另外，看楼主的电泳图条带比较弱，看来不只是降解，提取量也比较少。

这里对于增加提取量想说明一点，在研磨样品时，研得细和研得很细，提出的DNA量可以相差几倍！

所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！

主要试剂的配制

参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：

（1）0.5mo1/LEDTA（pH8.0）：

称取EDTA-Na218.61g，加80mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。

加入7mL10mo1/LNaOH调至pH8.0再用双蒸水定容到100mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20min。

（2）5mol/LNaCl溶液：

称取NaCl29.22g，溶解于90mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100mL，在高压灭菌20min。

（3）10mol/LNaOH溶液：

称取40.00gNaOH溶于80mL的双蒸水，搅拌，定容到100mL。

（4）1mol/LTris-HC1溶液（pH8.0）：

称取12.114gTris碱，溶于80mL的双蒸水，加入浓HC14.2mL，调整PH值到8.0，加水定容到100mL，高压灭菌20min。

（5）10%CTAB（m/v）：

称取CTAB10.00g，溶解于80mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100mL，室温保存。

（6）5mo1/LKAc溶液（pH4.8和6.5）：

分别称取KAc晶体49.07g，溶于80

mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH4.8和6.5，加双蒸水定容到100mL，在1.03×

105Pa下灭菌20min。

4℃保存。

（7）3mo1/LNaAc·3H2O溶液（pH5