流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
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取对数生长期的A549细胞,按1X10cells/mL以1mL接种于100mn培养皿内
24h后,进行所需的处理(比如加药,照射)
特定时间后终止培养,进行下一步的实验
收集原培养液,洗后的PBS和消化后的细胞,将三者混匀放入15ml
离心管中
lOOOrpm离心5min(短时低速离心)
弃上清,用1.5ml预冷PBSlOOOrpm离心5min后去除PBS和细胞
悬液内的细胞碎片
加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇,混匀后,于4C固定30min,或-20C长期保存。
1OOOr/min,离心5min
将乙醇吸除,加PBS青洗混匀
1000r/min,5min再离心一遍,将残留在细胞上的乙醇除去
吸除离心管内PBS加入200ulPBS和2ul的RNAB(0.25mg/ml)(37C下孵育30min)
加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min
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将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中(PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团),标记EP管
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提前一天网上预约
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开机(先开仪器后开软件)
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流式细胞仪的结构一般分为5部分:
①流动室及液流驱动系统;②
激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测、存贮、
显示、分析系统;⑤细胞分选系统。
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检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上
J
流动室内充满鞘液,细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱
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液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光(488nm激
发光源)
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荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料和细胞
DNA分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例)
在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出
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