核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备 2.docx

核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备 2.docx

《核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备 2.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备 2.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备2

分类号

密级

编号

毕业论文

题目核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备

学院生命科学与化学学院

姓名张彩霞

专业生物技术

学号252020139

指导教师王廷璞

提交日期2009-5-19

原创性声明

本人郑重声明：

本人所呈交的论文是在指导教师的指导下独立进行研究所取得的成果。

学位论文中凡是引用他人已经发表或未经发表的成果、数据、观点等均已明确注明出处。

除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。

本声明的法律责任由本人承担。

论文作者签名：

2009年5月19日

论文指导教师签名：

天水师范学院本科生毕业论文评定表

作者姓名

张彩霞

性别

女

学号

252020139

二级学院

生化学院

专业

生物技术

论文题目

核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备

英文名称

InfluenceofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowthandthepreparationofchitosan

论文字数

7000字

关键词

中文

核桃青皮浸泡液黑曲霉壳聚糖

外文

WalnutpeelextractAspergillusnigerchitosan

摘

要

中文

用孢子稀释涂板法和单因素控制变量法，研究核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖制备过程中的影响因素，并设计了基础培养液的正交试验。

结果表明核桃青皮浸取液对黑曲霉生长有促进作用，有利于大量培养黑曲霉。

培养液最佳配方为：

70ml玉米浆,4g葡萄糖,1.2g硫酸镁,8.0×108孢子量，10ml的核桃青皮浸取液，发酵液的pH值为7.4-7.6，温度为29℃，转速为130rpm的条件下发酵72小时的产率最高。

外文

TheinfluenceofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowth,andthefactorseffectsonthepreparationofchitosanwereinvestigatedwiththemethodsofdilutionplatecoatedwithspores,single-factorcontrolvariablesandtheorthogonaltestonbasicmedium,.TheresultsconfirmthepromotionofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowthandmassivecultivationofAspergillusniger.Theoptimummediumis:

70mlcornsteepliquor,4gglucose,1.2gofmagnesiumsulfate,8.0×108spores,10mlWalnutpeelextract,undertheconditionofpH7.4-7.6,29℃,130rpm.Thereisamaximumproductivityofchitosanafter72hoursfermentation.

指导教师评定

评定成绩

指导教师签名

答辩委员会意见

答辩委员会主任签字：

教务处审核：

目录

1.前言：

1

2.材料和方法4

2.1.实验药品与主要仪器：

4

2.2.实验方法：

4

3.实验结果与分析7

3.1.促菌作用7

3.2.发酵条件对壳聚糖产率的影响：

9

4.结论：

13

5.讨论：

13

参考文献15

核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖的制备

张彩霞指导老师:

王廷璞

（天水师范学院生命科学与化学学院生物系甘肃天水741001）

【摘要】:

用孢子稀释涂板法和单因素控制变量法，研究核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的影响及壳聚糖制备过程中的影响因素，并设计了基础培养液的正交试验。

结果表明核桃青皮浸取液对黑曲霉生长有促进作用，有利于大量培养黑曲霉培养液最佳配方为：

70ml玉米浆，4g葡萄糖，1.2g硫酸镁，8.0×108孢子量，10ml的核桃青皮浸取液，发酵液的pH值为7.4-7.6，温度为29℃，转速为130rpm的条件下发酵72小时的产率最高。

【关键词】：

核桃青皮浸泡液，黑曲霉，壳聚糖

InfluenceofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowthandthepreparationofchitosan

ZhangCaixiaZhangwenke

TutorWangTingpu

（TianshuinormaluniversityTianshuiGansu741001）

Abstract:

TheinfluenceofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowth，andthefactorseffectsonthepreparationofchitosanwereinvestigatedwiththemethodsofdilutionplatecoatedwithspores，single-factorcontrolvariablesandtheorthogonaltestonbasicmedium，TheresultsconfirmthepromotionofWalnutpeelextractonAspergillusnigergrowthandmassivecultivationofAspergillusniger.Theoptimummediumis:

70mlcornsteepliquor，4gglucose，1.2gofmagnesiumsulfate，8.0×108spores，10mlWalnutpeelextract，undertheconditionofpH7.4-7.6,29℃，130rpm.Thereisamaximumproductivityofchitosanafter72hoursfermentation.

Keywords:

WalnutpeelextractAspergillusnigerchitosan

1.前言：

壳聚糖（chitosan）为甲壳素的脱乙酰化的产物，是一种天然的生物高分子线形多糖。

在自然界中，壳聚糖广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、蝇蛆和昆虫的外壳，贝类、软体动物（如鱿鱼、乌贼）的外壳和软骨，高等植物的细胞壁等，每年生物合成的资源量高达100吨，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源，其中海洋生物的生成量在10亿吨以上，可以说是一种用之不竭的生物资源。

壳聚糖经自然界中的壳聚糖酶、溶菌酶等的完全生物降解后参与生态体系的碳和氮循环，对地球生态环境起着重要的调控作用[1]。

壳聚糖的特性与独特功用，越来越受到人们的广泛关注与积极研究，其主要应用领域有医药、食品、环保、农业等，并且国内外对壳聚糖特别是高纯度壳聚糖的需求与日俱增。

但就目前我国的壳聚糖制备技术而言，与国际尤其是美国、日本等国家的先进技术相比还存在很大的差距，因此，壳聚糖的制备工艺的研究成为很多学者研究的热点。

由于壳聚糖安全、无毒副作用，与生物器官有良好的相容性，并在降解的过程中不会产生任何有毒单质，还能为细胞生长提供所需的三维支架作用，能提供类似软骨基质的细胞外环境，维持细胞表型及功能，因此它最早被用在医学方面。

壳聚糖具有抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能,且具有无毒，无免疫原性、无热源反应、不溶血，良好的组织相容性等特性，具有极大的医学应用价值[2]。

而在1977年，日本首先将壳聚糖用于废水的处理，并于同年在国波士顿召开了第一届有关甲壳素和壳聚糖的国际会议，从此甲壳素和壳聚糖的开发应用才得到较大发展。

随后日本将壳聚糖减肥药品发展迅猛，已有成为减肥药主流的趋势。

日本厚生省1985年拨款60亿日元给一些医科大学，作为甲壳素基础研究和应用开发的费用[3]。

近年以来韩国除了在防治癌症、肝病、糖尿病、骨关节疾病研究之外，在食品添加剂、化妆品上应用也非常迅猛。

1.在生物学方面；日本已有专用于固定酶用的壳聚糖多孔颗粒商品出售。

美国利用壳聚糖制成的细胞用微载体已成为商品[4]。

2.在畜牧生产中的应用：

国外研究报道，甲壳素和壳聚糖用于牛饲料时，对瘤胃微生物发酵及营养物质消化率有很大的促进作用。

在奶牛饲料中添加甲壳素可提高牛奶的质量，日本等地每天将5～7g的甲壳素饲喂奶牛60d后牛奶蛋白质含量提高0.3%，提高了奶价，经济效益很好。

利用牛奶的无脂固形成分是影响价格的重要因素这一特点，将5～7g壳聚糖在60d内投放到奶牛的饲料中，结果牛奶中无脂固形成分平均增加0.3%，大大提高了牛奶的品位[5]。

3.在废水处理中：

2006年郝月等[6]研究了废水pH值、搅拌时间、壳聚糖投加量、沉降时间对絮凝效果的影响，通过正交实验确定优化处理条件。

对高浓度味精科废水进行混凝预处理研究表明，当pH值为5.3，搅拌时间为10min，壳聚糖浓度为2700mg/L，沉降时间为48h时，絮凝效果最佳，COD去除率达76.0%。

4.在食品保鲜中：

2007年王秀娟等[7]利用壳聚糖在肉类保鲜中的应用主要是利用该膜良好的成膜性、抑菌性和抗氧化性能，以壳聚糖涂膜保鲜对延长虾货架期的可行性及其效果进行了试验，结果能延长保质期2～3d。

且以浓度为1.5%壳聚糖保鲜效果最佳。

5.在医药方面：

2008年陈威等[8]提出，不同相对分子质量（Mr）的壳聚糖对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都具有较好的抑菌效果，但是引起钾离子和ATP的渗漏量却存在很大差异，提示小相对分子质量（Mr）壳聚糖很可能存在与大相对分子质量（Mr）壳聚糖不同的抑菌机制。

核桃青皮为山核桃未成熟时外部的一层厚厚的绿色果皮，随着核桃逐渐成熟青果皮会渐渐变黑，最后自然脱落。

它是一种有毒物质，正常人服用过量会导致死亡，但有癌症的人服用可以治病。

核桃青皮辛、苦、涩、有毒、微寒。

具有清热、解毒、止痢、明目、抗肿瘤的作用，能治泄泻、痢疾、白带、目赤等。

外用于皮肤疥癣、疣等皮肤病。

它有39种挥发油和7种脂肪酸，结果显示挥发油占79.09％、脂肪酸占19.02％，其中的挥发油有烃类、酮类、醇类、呋喃类、酚类、肟类、酯类七大类化合物，以倍半萜类为主，具有平喘、抑菌抗肿瘤作用。

脂肪酸中花生四烯酸的生物活性最强，体内含量最高，对其营养功能亦不可忽视[9]。

为了验证基础实验中核桃青皮浸泡液对黑曲霉有促进生长作用，通过对核桃青皮浸泡液促菌作用的研究，得知促进作用越强黑曲霉生长越好，菌落越多，从而有利于从中提取壳聚糖，研究壳聚糖制备过程中的影响因素，提高壳聚糖的产率。

通过对发酵制备壳聚糖工艺的研究，来获得较高的经济效益。

核桃青皮浸取液对黑曲霉生长的促进作用，目前在国内还没有相关研究性文章的发表，起初认为核桃青皮浸取液对黑曲霉生长有着抑制作用，但随着实验的初步进行才发现对黑曲霉有促进作用，促菌作用的机理，核桃青皮浸泡的浓度，促菌作用的效率等还处在研究当中。

黑曲霉发酵制备壳聚糖的研究已经取得了可观的成果，从发酵条件如温度，培养时间，摇床转速等做了科学详尽的研究，得到了最佳的发酵条件。

有些从培养基入手研究，本着对发酵原料来源广泛，价格低廉的目的进行培养基成分的正交实验，确定了即适合发酵，又来源广泛价格低廉的成份。

2.材料和方法

2.1.实验药品与主要仪器：

2.1.1.实验试剂：

酵母粉（OXOID），蛋白胨（OXOID），牛肉膏（北京奥博星生物技术有限公司）琼脂粉（北京奥博星生物技术有限公司），葡萄糖（成都金山化学试剂有限公司）分析纯，乙酸（天津市登丰化学药品有限公司）分析纯，乙醇（西安三津精细化工厂）分析纯，硫酸镁（西安三津精细化工厂）分析纯

菌种：

实验室保藏的黑曲霉菌种

2.1.2.实验仪器:

PHS–3DPH计上海雷磁

DK型电热恒温水浴锅上海精科实验设备有限公司

ZHJH–2122B超净工作台上海智诚分析仪器有限公司

ZRD–7080鼓风干燥箱上海智诚分析仪器有限公司

ZDP–2120电热培养箱上海智诚分析仪器有限公司

ZHWY–103恒温培养振荡器上海智诚分析仪器有限公司

TGL–20台式高速冷冻离心机长沙湘仪离心仪器有限公司

CX3型生物显微镜OLYMPUS

2.2.实验方法：

2.2.1.核桃青皮浸取液的制备

将核桃青皮片研磨成粉沫若干，然后用重蒸水清洗粉沫，清洗后将其在50℃－60℃的烘箱中烘干至衡重；称取一定量的核桃青皮粉沫，加入一定的无菌水在三角瓶中浸泡，将三角瓶置于40℃的恒温水浴锅中处理48小时即可，最后用4层纱布过滤浸泡液，弃去滤渣，保留清液备用。

2.2.2.核桃青皮浸泡液对黑曲霉生长的作用

称取削皮的马铃薯80g切成小片，加入一定量的水煮沸20min左右，然后用四层纱布过滤，取滤液再加入8g葡萄糖，8g琼脂加水至400ml，加热煮沸2min，最后和培养皿一起在121℃灭菌20min，所得到的为PDA培养基。

取上述100ml核桃青皮浸泡液于300ml三角瓶中，在121℃条件下灭菌30min。

在PDA真菌培养基活化保存在低温条件下的黑曲霉菌种。

血球板计数法计数黑曲霉孢子数：

在10ml无菌水中接种单菌落黑曲霉孢子及得原菌液，然后将原菌液依次稀释10倍，100倍……（稀释时注意使孢子完全分散）用血球板计数。

其结果如下表。

表1稀释10倍菌悬液孢子数

Figure1TheSporesIn10TimesDilution

小格孢子数

thesporesofsmallframe

每小格孢子平均数

theaveragesporesofsmallframe

X1

X2

X3

X4

X5

9

18

12

17

14

14

菌数（个/ml）=（X1+X2+X3+X4+X5）/5×25×104×稀释倍数=3.5×107

灭菌后在盛9ml无菌水的1号试管加入1ml的原菌液，使其混合均匀，再取1号管中的1ml菌液加入2号管9ml的无菌水中，依次类推进行稀释可得到10-1，10-2，10-310-4，10-5，10-6，在每个平板上涂100ul灭菌过的核桃青皮浸泡液，待完全吸收后（20min-30min）涂菌液，再在平板上按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6梯度涂50ul孢子悬液，观察并计数。

2.2.3.黑曲霉中碱裂解法提取壳聚糖

黑曲霉的发酵培养：

用4﹪葡萄糖，1％MgSO4，酵母粉和蛋白胨配成发酵培养液并选取培养好的单菌落，用接种环挑取孢子与种子培养液中培养24小时，然后用血球计数板计数，使发酵液中接入108个黑曲霉，将接种好的发酵液置于28℃，128rpm的恒温摇床上进行发酵。

壳聚糖的提取：

取发酵液100ml在10000rpm的离心机离心10min得菌体沉淀，加入重蒸水洗涤菌体沉淀至无色，称菌体的湿重与干重，然后在所得沉淀中加入7％NaOH（菌体湿重：

碱＝1：

10g/ml）50℃下处理3h后离心，重蒸水洗涤沉淀至上清液无色）；取上述沉淀，加入乙醇：

水＝1：

1的20％NaOH溶液（菌体湿重：

碱＝1：

10g/ml）与560W的微波炉处理10min，然后离心洗涤沉淀至上清液呈中性；接着取上述沉淀，加入5％乙酸（菌体湿重：

酸＝1：

15g/ml）置于100℃的水浴锅处理5h，离心分离，取上清液调节pH为8～10，直到出现大量白色沉淀为止，离心，用重蒸水洗涤沉淀至上清液呈中性，在50℃的真空干燥箱中干燥20min，得到白色固体，即为壳聚糖；加上述白色固体在分析天平上称重，并用壳聚糖产率的计算公式进行计算。

壳聚糖产率的计算：

2.2.4.发酵条件对壳聚糖产率的影响：

在制备壳聚糖过程中，壳聚糖产率受很多发酵条件影响，实验从发酵时间，发酵温度，摇床转速等因素进行了研究。

将发酵时间分别控制在24h，48h，72h，96h，每一个时间平行做3组，进行发酵培养，提取壳聚糖，进行比较分析。

将发酵温度分别控制在23℃，25℃，27℃，29℃，31℃，33℃，转速为130rpm培养72小时，提取壳聚糖，进行比较分析。

将发酵温度控制在29℃摇床分别取不同的转速120rpm，125rpm，130rpm，135rpm，140rpm，145rpm，进行发酵培养72小时，提取壳聚糖，进行比较分析。

2.2.5.基础培养液的正交试验

以培养基中葡萄糖、玉米浆和硫酸镁的含量及不同接种量为因素进行L9（34）正交试验，正交因素见表2：

表2基础培养液的正交试验

Figure2Theorthogonaltestonbasicmedium

序号

serialnumber

A玉米浆/ml

cornsteepliquor/ml

B葡萄糖/g

glucose/g

C硫酸镁/g

magnesiumsulfate/g

D孢子数/108

spores

1

70

3.0

1.0

7.0

2

70

3.5

1.1

8.0

3

70

4.0

1.2

9.0

4

72

3.0

1.2

8.0

5

72

3.5

1.0

9.0

6

72

4.0

1.1

7.0

7

80

3.0

1.1

9.0

8

80

3.5

1.2

7.0

9

80

4.0

1.0

8.0

3.2。

实验结果与分析

3.1.促进细菌生长作用

表324小时观察菌落

Figure3Thecoloniesobservedafter24hoursculture

菌的稀释数处理方法平行组

dilutionsofprocessingmethodparallelgroup

germ

12345

10-4

涂核桃青皮浸泡液withWalnutpeelextract

131

144

126

117

123

10-4

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

87

96

83

64

73

10-5

涂核桃青皮浸泡液

withWalnutpeelextract

23

31

27

19

34

10-5

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

11

17

13

13

21

10-6

涂核桃青皮浸泡液

withWalnutpeelextract

10

16

9

7

11

10-6

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

7

9

6

5

7

图124小时稀释倍数与菌落数的关系

Figure1thecoefficientbetweencoloniesanddilutionafter24hoursfermentation

表448小时观察菌落数

Figure4thecoloniesobservedafter48hoursculture

菌的稀释数处理方法平行组

dilutionsofprocessingmethodparallelgroup

germ

12345

10-4

涂核桃青皮浸泡液withWalnutpeelextract

菌落成片无法计数incalculability

10-4

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

10-5

涂核桃青皮浸泡液

withWalnutpeelextract

343

302

314

354

327

10-5

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

231

209

207

247

224

10-6

涂核桃青皮浸泡液

withWalnutpeelextract

181

197

167

172

189

10-6

未涂核桃青皮浸泡液

withoutWalnutpeelextract

116

121

107

112

123

图248小时稀释倍数与菌落数的关系

Figure2thecoefficientbetweencoloniesanddilutionafter48hoursfermentation

由上表数据和柱形图对涂核桃青皮浸泡液与未涂核桃青皮浸泡液的菌落进行统计和观察，可知未涂核桃青皮浸泡液的菌落数明显比涂核桃青皮浸泡液的菌落数少，因此核桃青皮浸泡液对黑曲霉的生长有显著的促进作用。

注：

若能用滤菌膜过滤核桃青皮浸泡液，促进作用会更加明显。

3.2.发酵条件对壳聚糖产率的影响：

3.2.1.发酵时间对产率的影响：

表5不同的发酵时间壳聚糖产率

Table5theproductivityofchitosanafterdifferentperiodoffermentation

发酵时间periodoffermentation

平行组

parallelgroup

平均值

average

1

2

3

24h

6.57

4.68

5.68

5.64

48h

9.21

10.83

10.6

10.21

72h

14.90

14.54

15.32

14.92

96h

14.25

13.24

14.91

14.13

表6不同的发酵时间对壳聚糖产率差异显著表

Table6thedifferencesofproductivityofchitosanafterdifferentperiodoffermentation

发酵时间/h

periodoffermentation

壳聚糖产率平均值

averageproductivityofchitosan

差异显著性

thedifferences

a=0.05

a=0.01

72

14.9186

a

A

96

14.1263

a

A

48

10.2019

b

B

24

5.6182

c

C

图3发酵时间与壳聚糖产率的关系

Figure3thecoefficientbetweenproductivityofchitosanandf