生物化学与分子生物学实验课讲义.docx
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生物化学与分子生物学实验课讲义.docx
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生物化学与分子生物学实验课讲义
实验一SDS碱裂解法小量制备质粒
一、实验目的
1.掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。
2.掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。
二、实验原理
对培养的含有大量质粒的菌液,离心收集菌体,用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体,采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁,使质粒缓和释放出来。
同时整个溶液的pH为12-12.5,使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上,当液体的pH调至中性并有高浓度存在下,大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀,而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态,离心获得含有大量质粒上清液,用RNA酶A处理除去RNA,用苯酚氯仿除去残留蛋白质,再利用核酸不溶于有机溶剂的性质,从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中(乙醇、异丙醇、PEG8000)沉淀析出。
三、材料、试剂和仪器
1.试剂
GT116(含psiRNA质粒)菌种
LB液体培养基
溶液I、溶液II、溶液III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素(配方见附录)
2.仪器和材料
超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器
四、实验操作步骤
1.在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3mlLB培养基,在37℃培养15-18个小时。
2.向1个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。
不要把菌液溅出造成污染。
3.10000rpm离心2分钟。
注意离心机上放置的管重力要平衡,保护离心机。
4.弃上清液于废液瓶中。
5.重复离心一次,尽量弃去上清。
6.加入100ul冰冷的溶液I,然后剧烈振荡混匀,置冰上。
7.加入200ul溶液II,轻柔混匀,置冰上4分钟。
8.加入150ul冰冷的溶液III,轻柔混匀,置冰上5分钟。
9.12000rpm离心5分钟。
把上清液转移到另一1.5ml离心管中(约450ul)。
10.加入等体积的酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)混合液,剧烈振荡,12000rpm离心2分钟,小心的收取上层溶液(约450ul)于另一1.5ml离心管中。
11.加入等体积氯仿:
异戊醇,剧烈振荡,12000rpm离心2分钟,小心的收取上层溶液(约400ul)于另一1.5ml离心管中。
12.2倍体积(800ul)-20℃预冷的无水乙醇,置冰上10分钟,沉淀质粒DNA。
13.12000rpm离心5分钟,弃上清
14.用1ml冰预冷的70%的乙醇洗沉淀,轻轻转动离心管,
15.12000rpm离心1分钟,弃上清液。
16.室温干燥沉淀。
加入50ulTE(含20ug/mlRNA酶A)溶解质粒,-20℃保存。
五、质粒相关知识
质粒是细胞染色外一种双链环状DNA分子,它随寄主细胞稳定遗传。
对于质粒的研究始于1946年,美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子(F因子),随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子(R因子),大肠杆菌素因子(CoE)等,并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究,为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。
质粒DNA在细菌中的复制分为严紧型(stringentcontrol)和松弛型(relaxedcontrol)。
严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在,只随染色体的复制而复制,其拷贝数少,每个细胞中只有1-10个;松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶Ⅰ,它在细胞生长周期中随时可以复制,每个细胞中有10-200以上个拷贝。
为了便于基因克隆,作为载体的质粒特点如下:
1.是一个复制子,能自我复制。
使它携带的目的基因得到大量扩增。
2.分子量小(相对分子质量一般在106-107),拷贝数要高,便于应用(如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等)。
3.至少要有两个便于选择的遗传标记,其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中,例如载体中引入的LacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽,可以被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导合成,新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补,产生有活性的β-半乳糖苷酶,该酶能够水解X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成蓝色的溴氯吲哚,使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。
若有外源DNA插入LacZ中,因不能合成正确的α-肽,转化或转染的Lac缺陷菌株,用X-gal筛选,含阳性无隆载体的菌落为白色,含空载体的菌落为蓝色;其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落,如氨苄青霉素抗性基因(Ampr),只有已转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。
4.有多个单一的酶切位点,起点在某个遗传标记上,便于基因克隆,鉴定。
提取的质粒多数以超螺旋型存在,超螺旋的DNA中一个螺旋由10个碱基形成,若一个螺旋大于或小于19个碱基时,分子内就产生一种力量,外于不稳定状态,当分子上有一个缺刻时,分子会立即松驰,形成开环分子。
一般超螺旋型质粒应占到总量70%。
否则反思你的每步操作是否正确。
六、思考题
1.分离纯化核酸(质粒DNA)应遵循那些原则(或注意那些事项)?
2.溶液I、溶液II、溶液III、酚、氯仿、无水乙醇、等主要试剂各有何作用?
实验二分光光度法测定DNA的浓度和纯度
一实验目的
1.掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。
2.熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二实验原理
DNA和RNA吸收光谱的最大值位于260nm,因此可以通过测定OD260来计算样品中DNA和RNA的浓度,一个OD值相当于约50μg/ml的双链DNA、40μg/ml的单链DNA和RNA以及33μg/ml的单链寡核苷酸。
利用260nm和280nm两处读数的比值(OD260:
OD280)可以估算核酸的纯度。
三材料、试剂和仪器
1.仪器:
美谱达UV-3100紫外分光光度计
2.试剂:
待测质粒DNA溶液
四、实验步骤
1.打开外部电源主机电源。
2.仪器自检
当打开仪器电源时,仪器便进入自检程序,预热15分钟,自检各项都“OK”后,进入选择工作方式界面。
3.选择菜单第五项“DNA/蛋白质测量”
4.按F2键选择测量方法。
“吸光度差1”模式或“吸光度差2”模式被选定后,再选择是否“测量背景”。
“吸光度差1”模式测量波长为260nm和280nm,背景波长320nm;“吸光度差2”模式的测量波长为260nm和230nm,背景波长为320nm。
3.光度测量未知DNA、RNA浓度的测定:
(1)选择“吸光度差1”模式
(3)校零
在样品池中放入参比溶液(1×TE),按【0Abs/100%T】键,仪器进行自动校零,校完后取出参比溶液。
(4)测量
将取出的参比溶液倒掉,换上样品溶液,放入样品池内,按START即可测量样品吸光度值。
若有多个样品要测试,只需再按TART即可。
注意:
仅在吸光度为0~1之间时,吸光度值和DNA浓度才有良好的线性关系。
小量制备的质粒DNA浓度一般约为几ug/ul,因此需要稀释约100倍进行测量。
如果浓度仍超过测量范围,需要继续稀释。
每次至少需向微量比色皿中注入400ul溶液才可准确测量。
4.结果计算
(1)依据下式计算DNA的浓度:
A260×50×稀释倍数=样品浓度(ug/ml)
(2)计算比值:
A260/A280=
DNA的吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的吸收高峰为280nm。
纯DNAA260/A280为1.8,纯RNAA260/A280为2.0。
A260/A280小于1.8,则表明样品中混有较多的蛋白质。
若A260/A280接近2.0,则表明样品中含有较多RNA。
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
一.实验目的
1.学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。
二.实验原理
由于DNA结构的重复性,核苷酸数相同的DNA几乎具有等量的净电荷,所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异,而真正决定DNA分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于DNA分子的大小、构象、构型。
采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,以达到分离的目的。
三.材料、试剂和仪器
1.质粒DNA、细菌基因组DNA
2.琼脂糖、6×LoadingBuffer、DNA分子量marker、溴化乙啶(EB)
3.仪器:
琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射仪、数码相机
四.实验步骤
1.凝胶的制备
(1)配0.7%的胶:
称取0.21g的琼脂糖,置于三角瓶中,加入1×TAE30ml,盖上铝箔纸,放在微波炉中化胶,注意用中低火(约1~2分钟),避免沸腾和溢出。
(2)轻旋转三角瓶把胶混匀,使胶的温度冷却至50℃—60℃。
(3)正确安装制胶模及梳子。
(4)将琼脂糖溶液倒入胶模中,并防止梳子的齿下或齿间及凝胶中产生气泡。
(5)室温静置约30分钟,使胶能完全凝固。
轻轻拔出梳子,把胶放入调好水平、装有适量缓冲液的电泳槽内,待用。
2.电泳
(6)在透明胶带纸上分滴6×的上样缓冲液1微升/滴,然后于5微升DNA液混匀,加入到上样孔上(用微量移液器的tip头插入1mm深处,轻轻推进样品,可以看见样品下沉)。
同时上标准DNA分子量Marker。
(7)盖上电泳槽并通电1~5V/cm,使DNA向阳极移动。
当指示剂泳动至胶的另一端就可停止电泳。
(8)切断电流,取出凝胶,将胶浸入0.5μg/ml的EB溶液中10分钟,取出后用水漂洗2分钟,在紫外透射仪下检查凝胶并摄影。
注意:
EB是强烈的诱变剂,须小心处理。
五.思考题
1.哪些因素会影响核酸在琼脂糖凝胶中的泳动?
实验四CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA
一.实验目的
1.掌握用CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA
2.了解基因组DNA的其它提取方法
二.实验原理
CTAB是一种阳离子去污剂,在高离子强度的溶液里,CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。
因此,CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括E.coli的某些株)中制备纯化DNA。
本实验用SDS破碎细胞,利用蛋白酶K消化蛋白,CTAB沉淀多糖,再经加热使蛋白变性与DNA分离,经酚氯仿抽提后,乙醇沉淀核酸,得到总DNA。
三.材料、试剂和仪器
1.大肠杆菌G116
2.TE(pH8.0)、CTAB、蛋白酶K、NaCl、氯仿
6.无水乙醇
8.仪器:
高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、
四.实验步骤
1.取1.5ml菌液于2ml离心管,10000rpm离心2min,倒去上请,重复该步骤一次。
2.加入567μlTE(pH8.0),使菌体完全悬浮。
3.加入30μl10%SDS于离心管中,再加入3μl20mg/ml蛋白酶K,充分混匀。
37°C反应1h。
4.加入100μl5MNaCl,80μlCTAB/NaCl,混匀,65°C反应10min。
5.加入780μl酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1),充分混匀,12000rmp室温离心5min。
6.转移上清至新的2ml离心管,再加入等体积氯仿/异戊醇(24:
1),充分混匀,12000rmp室温离心5min。
7.转移上清至新的2ml离心管,加入1/10体积的3M醋酸钠,2倍体积的无水乙醇,混匀。
8.-20°C放置30min或者更长时间。
9.13000rmp,离心10min。
去上清,加入70%乙醇洗涤沉淀,再13000rmp,离心10min。
10.去上清,室温干燥DNA沉淀。
11.沉淀干燥后加入200μl1×TE(pH8.0)溶解沉淀。
五.思考题
试比较细菌基因组DNA和质粒DNA提取方法的异同?
实验五质粒DNA的酶切分析
一.实验目的
1.了解酶切原理。
2.掌握酶切体系的建立原则。
3.熟悉基因工程所用限制性内切酶的特点。
二.实验原理
分子生物学中使用的DNA限制性内切酶主要是II型II酶,有EcoRI、BamHI、HindII、HindIII等。
其识别的特定碱基顺序,并有特异性的酶切位点,因而DNA分子经过II类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
相当一部分酶(如EcoRI、BamHI、Hind等)的切口,作用点有180°旋转对称性,因而可形成粘性末端,但也有一些II类酶如A1uI、BsuRI、BalI、HalIII、HPaI、SmaI等切割DNA分子并不产生粘性末端,而只形成平整末端。
依据限制性内切酶的生物学活性特点,建立一个细胞体外的液体环境,使酶能够最大限度地发挥其切割DNA的作用。
三.材料、试剂和仪器
1.质粒DNA(psiRNA)
2.限制性内切酶BpiI及其Buffer
3.仪器:
水浴锅、琼脂糖凝胶电泳系统等
四.实验步骤
1.酶切反应体系
质粒(psiRNA)8μl
10×反应缓冲液2μl
酶(HindII或BpiI)1μl
H2O9μl
2.向一个管内加入以上各个成分,注意各成分的体积要准确,酶最后加入。
3.混匀管中的各成分后再离心到管底。
4.放在37℃,1小时。
5.琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,酶切产物可以进一步进行重组。
五.思考题
1.简要说明切酶反应电泳图谱,其结果说明了什么问题?
2.酶切反应的关键有哪些?
实验六质粒载体与外源DNA片段的连接
一.实验目的
学习掌握外源DNA与质粒载体的重组连接技术
二.实验原理
用限制性内切酶(如BpiI)酶切质粒后形成线性化载体,载体带有粘性末端。
预先获得的双链目的DNA片段两端也带有与其互补的粘性末端。
这样线性化载体的两段就可以目的DNA片段的两段进行正确的配对。
在连接酶的催化下,就可以把目的片段连接到质粒载体中,形成含有目的片断的重组载体。
此连接产物可转化感受态细胞并进行重组克隆的筛选。
三.材料、试剂和仪器
1.带粘性末端的双链DNA片段
2.酶切过的质粒(psiRNA)
3.仪器:
恒温仪或低温水浴锅
四.实验步骤
1.反应体系:
20μl反应体系:
μl
灭菌蒸馏水13
外源片段3
T4DNALigaseBuffer(10)2
酶切过的质粒(psiRNA)1
T4DNALigase(5-10U/μl)1
2.混匀反应液,在恒温仪中16℃过夜
五.思考题
1连接反应中如何优化载体与外源片段的比例?
2目的基因的获得有哪些途径?
实验七CaCl2法制备E.coli感受态细胞
一、实验目的
通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。
二、实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如kanamycin等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。
三.材料、试剂和仪器
1.GT116菌株
2.LB培养基
3.0.1MCaCl2:
4.0.1MCaCl2-MgCl2:
5.灭菌甘油
6.仪器:
冷冻离心机、冰盒等
四.实验步骤
1.从冻存管取菌GT116划LB平板,37℃过夜培养。
2.挑取形态饱满单菌落,接种3mlLB液体培养基,250rpm,37℃过夜培养。
3.1:
100转接至100mlLB液体培养基,37℃,250rpm培养2~3h,测OD600=0.35~0.4(培养2.5小时后开始取液测OD,每10min测一次,直至OD=0.4,立即停止培养)
4.冰上预冷1个2mlEP管,取菌至EP管,每管1.5ml,冰上放置10min。
5.4000rpm,4℃,离心10min。
6.小心倒掉上清,将管倒置纸巾上1min流尽残液。
7.每管加入500μl预冷的0.1MCaCl2-MgCl2重悬细胞沉淀,冰浴15min。
8.小心倒掉上清,将管倒置纸巾上1min流尽残液。
9.每管加100μl冰预冷的0.1MCaCL2重悬菌体。
此时可以按实验八的步骤进行转化实验,也可加入总体积15%的甘油冻存于-80℃。
五.思考题
CaCl2法制备感受态细胞的原理可能是什么?
实验八重组DNA的转化和克隆筛选
一.实验目的
1.熟练掌握用重组DNA转化感受态细胞的技术,为基因克隆打好基础
2.学习掌握蓝白筛选重组子的原理及操作方法
二.实验原理
转化是将外源DNA分子入受体细胞,使之获得新的遗传特征的一种方法,它是微生物遗传、基因工程研究等领域的基本实验技术。
本实验用的psiRNA质粒带有卡那霉素抗性基因(Kan)和LacZ基因。
可通过Kan抗性和α互补两种特征来筛选转化子,即:
不带有psiRNA质粒DNA的细胞,因无Kan抗性,不能在含有Kan的选择培养基上生长,仅有psiRNA载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在选择培养基上呈现为蓝色菌落;只带有重组质粒转化子由于失去了β-半乳糖苷酶活性,故呈现为白色菌落,白色菌落就是转化子。
转化子扩增后,可将转化的质粒DNA提出,进行电泳和酶切等进一步鉴定。
三.材料、试剂和仪器
1.GT116感受态细胞悬液
2.重组DNA质粒连接溶液
3.液体SOC培养基、Kan-SOB培养基平板
4.pUC19质粒DNA
5.灭菌ddH2O
6.X-ga1(2%,m/v):
0.2gX-ga1,用10ml二甲基甲酰胺溶解
7.IPTG(20%,m/v):
2gIPTG,加10mldH2O溶解
8.仪器:
水浴锅、冰盒
四.实验步骤
1.取100μl摇匀后的感受态细胞悬液(如果是冰冻保存则需在冰上解化冻后进行下述的操作)
2.加入重组质粒DNA连接溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻吹打以混合内容物,冰上放置30分钟。
3.将管放入42℃水浴中,恰好90s。
4.快速将管转移到冰浴中,冷却2min。
5.每管加入400μlSOC培养基,(预先加热SOC培养基至37℃),然后将管转移到摇床上100rpm轻柔摇动,45min。
6.将7ul20%IPTG与40ul2%X-gal混合,用铺菌器平铺于Kan-SOB培养基平板表面,静置数分钟晾干。
7.将菌液用移液器轻轻吹打均匀。
将适当体积(每个平板200μl)已转化的细胞转移到已铺有IPTG和X-gal的Kan-SOB培养基平板上。
8.将平板置于室温直至液体被吸收。
9.倒置平板,37℃培养过夜,观察菌落。
10.对需显色反应的筛选培养基还需理将平板放于4℃冰箱3-4小时,使显色反应充分,蓝色菌落明显。
五.思考题
1..细菌转化实验应注意哪些事项?
2.如何理解蓝白斑筛选(α-互补现象)
实验九利用PCR技术从质粒DNA扩增功能基因
一.实验目的
学习掌握PCR技术的原理及基本操作
二.实验原理
PCR(PolymeraseChainReaction)技术是KaryMullis在1985年建立起来的在细胞外扩增合成DNA的一种方法,即利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性,在附加两个引物与模板杂交之后,按碱基配对的原则经酶促反应合成DNA片断,包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间的DNA的一定次数的重复循环,使包括在两个引物5’端限定的特异片断形成指数式积累。
三.材料、试剂和仪器
1.重组前和重组后的质粒(psiRNA)DNA
2.上游和下游引物
3.4种dNTPs、Taqpolymerase及其Buffer、ddH2O
4.仪器:
PCR仪、冰盒、凝胶电泳检测系统等
四.实验步骤
1.反应体系(μl)
水:
38
质粒:
0.75
buffer:
5
dNTP:
4
引物1:
1
引物2:
1
酶:
0.25
2.反应条件
94℃5min——94℃30s——57℃30s——72℃30s——72℃7min——4℃2h
||
―――――30cycles――――
3.反应完成后,取3μl做电泳以鉴定PCR产物。
五.思考题
1.影响PCR效果的因素主要有哪些?
2.举例说明PCR技术的应用
实验十考马斯亮蓝法定量测定蛋白质
一、实验目的:
学习考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是:
(1)灵敏度高,
(2)测定快速、简便,(3)干扰物质少。
但是仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:
去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
三、试剂与器材
1、试剂
考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL。
2、标准和待测蛋白质溶液
(1)标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白,用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
(2)待测蛋白质溶液。
3、器材
恒温水浴;分光光度计。
四、实验方法
1、制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作。
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液(mL)
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.15mol/LNaCl(mL)
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂(mL)
5mL
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线:
以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
2、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上,取合适的未知样品体积,稀释至其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓
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- 关 键 词:
- 生物化学 分子生物学 实验 讲义