工程化骨对促进骨缺损修复的实验研究.docx

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工程化骨对促进骨缺损修复的实验研究

hBMP-2基因转染血管内皮祖细胞和脂肪间充质干细胞构建工程化骨对促进骨缺损修复的实验研究

一.立题依据

1.研究意义：

骨缺损、特别是大段骨缺损常因战创伤高能量损伤性骨折、严重开放性骨折伴感染、骨不连多次手术植骨内固定失败、骨髓炎病理性骨折及大块死骨切除、先天性胫骨假关节及肿瘤大段骨切除等所致。

传统的手术治疗方法极为困难，最终很多病例不得不采用截肢术或用支具保护性负重[1]。

因此其治疗成为骨科临床的一大难点，探索新的治疗手段成为当前国内外骨科界的迫切需求。

近年来，骨组织工程技术成为骨缺损修复的研究重点。

其研究多集中在种子细胞的选择与培养及支架材料的选择与修饰两方面。

国内外许多学者和我们的早期研究证明，用组织工程骨修复小段骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显。

但应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好解决组织工程骨的血管化问题[2]。

骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生及骨端融合,其中血管化是关键环节,其作用贯穿于整个移植修复过程,对骨再生与融合的方式及效果起决定作用[3]。

体外构建的组织工程骨尤其是大体积组织工程骨植入体内后必须迅速建立充分的血供,将成骨细胞前体细胞、相关因子、营养物质及其他参与骨修复的细胞带到局部微环境中,并带走新陈代谢产生的废物及坏死和分解产物,为种子细胞的生存和发展提供营养,从整体上维持有利于这一生理过程的代谢微环境[4]。

血管内皮祖细胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）最早由Asahara等于1997年报道，它是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，体外培养后能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。

它不仅参与人胚胎血管生成，而且在骨髓、脐带血及外周血中均存在能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管的EPCs[5-6]。

这一发现，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。

BMPs是1965年由Urist等首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种有活性的蛋白质。

这种活性蛋白具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞,并进而合成胶原,形成钙化的骨组织能力,因此命名为骨形态发生蛋白。

BMP-2是目前国内外研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMPs成员之一。

脂肪基质细胞中含有大量具有多向分化潜能的干细胞，这些干细胞具有自我更新和一定的分化潜能，是处于全能细胞和成熟细胞之间的中间体，称之为脂肪间充质干细（Adipose-derived

mesenchymalstemcells,ADMSCs）。

在自然条件下倾向于分化成脂肪组织的各种细胞，用于维持机体的新陈代谢，但在特定的外界条件诱导下，可分化为多种细胞。

脂肪间充质干细胞自被发现以来，已经证实可以定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞等[7-9]。

BMP2可增加脂肪间充质干细胞内碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）等的mRNA及蛋白的合成,使其定向分化为成骨细胞;同时BMP2还可抑制细胞向脂肪细胞分化[10]。

Dragoo等[11]人认为转染有BMP-2基因的人PLA细胞，与培养液中添加rh-BMP诱导剂组的PLA细胞相比更易分化形成成骨细胞。

AMSCs和BMSCs都来自于间充质，具有大量的相似性。

Deugarte等[12]将从人类同一个样本获得的不同来源的MSCs进行了细胞的采集和分离、生长动力学和衰亡、体外的分化及基因转染等几个方面的比较发现，两者在原代传代培养、细胞凋亡、成脂和成骨诱导分化等没有明显差异。

鞠洪斌等[13]发现脂肪间充质干细胞（AMSCs）比骨髓间充质干细胞（MSCs）的增殖能力更强。

有研究证实，大量获得的MSCs细胞的死亡率很高[14]。

本实验通过构建pcDNA3.1-BMP2质粒，转染EPCs并在EPCs中表达BMP2，进一步诱导AMCss向成骨细胞、软骨细胞分化，将EPCs和AMCss作为种子细胞接种于脱钙骨基质（DBM）支架，共同构建促血管化组织工程骨，观察组织工程骨的早期血管化程度及骨缺损区新生骨愈合效果。

为基因转染EPCs和AMCss在骨缺损、特别是大段骨缺损的修复方面的应用提供科学的实验基础及理论依据。

2.国内外研究现状

Alexander等[15]将EPCs直接注入心肌梗塞大鼠模型的心肌缺血区域，4周后发现，cd31染色阳性的新生血管内皮细胞明显增多，冠状动脉血流增加，超声心动图示左心室泵血功能改善较明显。

吴雪晖等[16]从兔自体骨髓中分离获得单个核细胞，在含有Singlequot组合添加剂的EGM22完全培养液中培养，得到EPCs。

与骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,MSCs）和脱钙骨基质构建组织工程骨，移植修复桡骨缺损，结果示，术后4、8、12周,EPCs组的骨密度明显高于对照组,X线示EPCs组骨痂明显多于对照组,8周可见EPCs组髓腔部分再通,对照组髓腔尚封闭。

12周EPCs组新生骨密度均匀,髓腔已完全再通,对照组新生骨仍可见部分低密度区,髓腔大部分再通,X线示EPCs组新生骨已基本完成塑形,对照组髓腔完全再通,新生骨处于重建塑形期。

B.Yue等[17]将BMP2基因转染骨髓间充质干细胞（MSCs）后发现，在BMP2蛋白表达同时，碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原酶，骨桥蛋白，骨唾液蛋白在培养基的表达也随着增加，将其移植至老年大鼠骨缺损模型中，发现转染BMP2基因后的MSCs表现出强大的诱导成骨活性，对骨缺损的修复起到重要的作用。

LingWu等[18]将锌指蛋白基因真核表达载体（pcDNA3.1-Osx）导入脂肪间充质干细胞（AMSCs），并移植于大鼠体内，RT-PCR和免疫组化结果显示，Osx基因表达产物能促进ASCs表达骨唾液蛋白，骨桥蛋白，胶原蛋白Ⅰ等骨基础蛋白，并增强碱性磷酸酶的活力，促进ASCs成骨。

王海燕等[19]切取乳兔腹股沟、腋下脂肪，分离，培养获得ASCs，经诱导培养基（1%FBS、H-DMEM、10μg/LTGF-β1、50μg/LIGF、100μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素）诱导后，ADMSCs由成纤维细胞的长梭形变为多角短梭形，细胞密集处呈铺路石状甚至由于基质包裹成圆形，诱导14d时有软骨结节形成，细胞表面CD29、CD34分子表达阳性，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性，阿尔新蓝染色异染，说明产生了软骨特征性Ⅱ型胶原和糖氨多糖，具有软骨细胞表型。

3.参考文献

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2.LiZ,LiZB.Repairofmandibledefectwithtissueengineeringboneinrabbits.ANZSurg,2005,75（11）:

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3.VanderLindenS,ValkenburgHA,CatsA.Evaluationofdiagnosticcriteriaforankylosingspondylitis:

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4.GarrettS,JenkinsonT,KennedyLG,etal.Anewapproachtodefiningdiseasestatusinankylosingspondylitis:

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7.PetersonB,ZhangJ,IglesiasR,KaboM,HedrickM,BenhaimP,LiebermanJR（2005）Healingofcriticallysizedfemoraldefects,usinggeneticallymodifiedmesenchymalstemcellsfromhumanadiposetissue.TissueEng11:

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8.KramerJ,BohrnsenF,SchlenkeP,etal.Stemcell-derivedchondrocytesforregenerativemedicine.TransplantionProceedings2006;38（3）:

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9.Planat-BenardV,SilvestreJS,CousinB,etal.Plasticityofhumanadiposelineagecellstowardendothelialcells:

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10.LiuP,OyajobiBO,RussellRG.Regulationofosteogenicdifferentatiationofhumanbonemarrowstromalcells:

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11.DragooJL,ChoiJY,LiebermanJR,etal.BoneinductionbyBMP-2transducedstemcellsderivedfromhumanfat[J].JournalofOrthopaedicResearch,2003,21（4）:

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12.DeUgarteDA，MorizonoK，etal.Comparisonofmulti-lineagecellsformhumanadiposetissueandbonemarrow.CellsTisseOgrnas，2003，174:

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13.鞠洪斌.大鼠脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨分化比较的体外研究.博士论文，2006.

14.Nishimori，M.Yetal.Health-relatedqualityoflifeofunrelatedbonemarrowdonorsinJaPan.Blood.2002（99）:

1995-2001.

15.吴雪晖,许建中,王序全，等.血管内皮祖细胞对组织工程骨成骨能力影响的实验研究.重庆医学，2006：

35（22）：

2058-2062.

16.B.Yue，B.Lu,K.R.Dai，etal.BMP2GeneTherapyontheRepairofBoneDefectsofAgedRats.CalcifTissueInternational,2005,77:

395-403.

17.AlexanderSchuh,ElisaA.Liehn,AlexanderSasse，etal.BasicResearchinCardiology.2008,103,69-77.

18.LingWu，YaoWu，YunfengLin，etal.OsteogenicdifferentiationofadiposederivedstemcellspromotedbyoverexpressionofosterixMolCellBiochem,2007,301:

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19.王海燕，耿排力，吕同德，等.乳兔脂肪间充质干细胞体外高密微团培养及向软骨细胞的分化.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（16）：

3092-3096.

二.研究方案

1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1.1研究目标

本实验通过构建pcDNA3-BMP2质粒，转染EPCs并在EPCs中表达BMP2，诱导AMCss向成骨细胞、软骨细胞分化，将EPCs和AMCss作为种子细胞接种于脱钙骨基质（DBM）支架，共同构建促血管化组织工程骨，观察组织工程骨的早期血管化程度及骨缺损区新生骨愈合效果。

为基因转染EPCs和AMCss在骨缺损、特别是大段骨缺损的修复方面的应用提供科学的理论及实验依据。

1.2研究内容

（1）pcDNA3-BMP2质粒的构建及鉴定

（2）血管内皮组细胞的分离、培养和鉴定

（3）pcDNA3-BMP2质粒体外转染EPCs

（4）脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定

（5）血管内皮祖细胞和脂肪间充质干细胞组织工程骨的体外构建

（6）血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复兔桡骨缺损的研究

1.3拟解决的关键问题

（1）兔骨髓来源的血管内皮祖细胞的分离纯化、体外培养及诱导鉴定。

（2）pcDNA3.1-BMP2真核表达载体的构建和转染细胞的较佳方式。

（3）脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定。

（4）诱导脂肪间充质干细胞成骨分化的BMP2浓度和诱导时机。

（5）建立AMSCs的鉴定筛选标准和高效的定向诱导体系。

2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

2.1研究方法：

（1）克隆质粒psp-65BMP2和pcDNA3.1质粒DNA经酶切电泳获取目的片段，经T4DNA连接酶连接形成pcDNA3.1-BMP2质粒；pcDNA3.1-BMP2质粒在细菌中克隆扩增；裂解，抽提质粒，并行酶切鉴定；反向蒸发法制备脂质体包埋质粒。

（2）采用密度梯度离心法收集兔自体骨髓中的单个核细胞，在特定的诱导条件下通过贴壁培养、扩增获取足够数量的EPCs。

（3）倒置显微镜下观察，流式细胞仪检测细胞表面标VEGFR-2和CD133，vWF和VEGFR-2免疫组化染色，免疫双荧光染色等方法鉴定所得细胞。

（4）pcDNA3.1-BMP2质粒直接导入EPCs。

（5）采用胶原酶消化分离方法新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织分离得到脂肪MSCs，贴壁培养、扩增获取足够数量AMCss。

（6）倒置显微镜下观察，表面的CD29、34分子的检测，MTT法检测细胞生长曲线等方法鉴定所得细胞。

（7）血管内皮祖细胞和脂肪间充质干细胞组织工程骨的体外构建。

（8）兔桡骨缺损模型的建立，组织工程骨植入骨缺损区后骨愈合的观察。

2.2技术路线：

（1）pcDNA3.1-BMP2质粒的构建及鉴定

BMP2目的片断

新西兰大耳白兔

（2）血管内皮组细胞的分离、培养、鉴定和基因转染

倒置显微镜下观察，流式细胞仪检测细胞表面标记，免疫组化染色，免疫双荧光染色等方法鉴定所得细胞

（3）脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定

（4）骨缺损动物模型建立和组织工程骨的体外构建、移植

脱钙骨基质（DBM）支架的制备

EPCs和ADMSCs1:

1的比例

转移至DBM支架上，培养4h

2.3实验方案：

2.3.1.实验动物健康4-5月龄成年新西兰大耳白兔80只，体重2.1-2.6kg，雌雄不限（广东医学院实验动物中心提供）。

随机分为四组，利用同一动物双侧前肢进行自身对照。

根据骨缺损处植入物不同分为实验A组（右侧前肢，转染EPCs+ADMSCs+DBM），实验B组（未转染EPCs+ADMSCs+DBM），自身对照组（左侧前肢，ADMSCs+DBM），阴性对照组（DBM）。

2.3.2pcDNA3.1-BMP2质粒的构建及鉴定

1.pcDNA3.1-BMP2质粒构建：

取克隆质粒psp-65BMP2经XbaI和SalI双酶切于37C温育2h，加入溴酚蓝3ul，与DL2000Marker一起做琼脂糖凝胶电泳，获得1.2kd目的条带。

取pcDNA3.1质粒DNA经XbaI和XhoI双酶切于37oC温育2h，加入溴酚蓝3ul，与λDNA/EcoRI+HindⅢMarker一起做琼脂糖凝胶电泳，获得3.0kd目的条带,切取目的条带，将含有目的片段的琼脂糖凝胶经DNA纯化回收盒回收。

取经XbaI、SalⅠ双酶切的BMP2目的片段经XbaI和XhoI双酶切的pcDNA3.1片段加入T4DNA连接酶16OC连接12h。

转化感受态细胞，取100ul菌体悬液涂布于含100ug/ml氨苄青霉素钠的LB平板上。

平皿于37OC平放20min，待菌液干后，37OC倒置培养12-16h，可见菌落出现。

2．真核表达载体pcDNA3-BMP2的鉴定：

挑取菌落进行摇菌扩增，碱裂解法裂解质粒，并用抽提试剂提取质粒。

取质粒，经EcoRI单酶切。

加入溴酚蓝3ul，与DL2000Marker和λDNA/EcoRI+HindⅢMarker一起在0.8%琼脂糖凝胶电泳，初步筛选。

初筛结束后用XbaI和EcoRI双酶切，37oC温育2h。

取上述双酶切标本加入DL2000Marker和λDNA/EcoRI+HindⅢMarker一起在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。

3.用反向蒸发法制备脂质体包埋重组质粒：

分别称取卵磷脂30mg、胆固醇15mg和十八胺2mg，完全溶解于10ml乙醚中；取上述大量提取的质粒溶于磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，超声波乳化至不分层；反向蒸发至乙醚完全去除。

转入小瓶，终体积定容，pcDNA3-BMP2脂质体复合物,4℃保存备用。

2.3.3血管内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

1.血管内皮祖细胞的分离、培养：

在10ml的无菌玻璃离心管中,加入4ml密度为1.073g/ml的Percoll分离液。

抽取兔双侧髂骨骨髓4ml,缓慢加入上述离心管中,20℃,400g离心20min,吸取中间乳白色云雾状有核细胞层到无菌的50ml离心管中,加入D2Hanks液20ml轻柔吹打漂洗。

200g离心5min,弃上清,获得单个核细胞备用。

加入含Singlequot组合添加剂的EGM22完全培养液至4ml,反复吹打,将细胞混匀,制成细胞悬液。

0.4%台盼蓝染色,活细胞率>95%。

将细胞接种于事先包被了5μg/ml纤维连接蛋白的培养瓶中,加入EGM22完全培养液5ml。

37℃,5%CO2浓度,饱和湿度培养。

3d后首次全量换液,弃去悬浮细胞,继续培养。

2.血管内皮组细胞的鉴定：

（1）培养的第4d、第7d和第10d在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

（2）培养的第4、7、10天进行贴附细胞表面标记CD34、血管内皮细胞生长因子受体及CD133的免疫荧光组织化学染色。

2.3.4pcDNA3-BMP2质粒体外转染EPCs

1.pcDNA3-BMP2质粒体外转染EPCs:

培养第7天细胞融合约50%的EPCs在24孔板中进行转染。

按照脂质体Geneporter2试剂盒说明书步骤操作进行转染,转染时pcDNA3-BMP2质粒与脂质体比例为1μg∶5μl,转染时均用无血清M199培养基,转染24h后换成原培养基。

G418400mg/ml进行压力筛选,并对照观察筛选后形成的阳性集落。

2.外分泌BMP2蛋白表达的酶联免疫吸附法（ELISA）检测:

将G418筛选后的细胞培养3周,用BMP2的ELISA试剂盒检测培养基中转染后1、4、7、14、21d上清蛋白表达水平。

450nm可见光比色得吸光值,对标准品中BMP2蛋白含量绘制标准曲线,将细胞培养上清中测得的吸光值在标准曲线上确定其BMP2蛋白含量。

2.3.5脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定

1.脂肪间充质干细胞（ADMSCs）体外分离、培养：

无菌条件下，取兔腹股沟、腋下脂肪，剔除结缔组织和血管，剪成1mm×1mm大小。

预冷的无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2遍；加入4mL0.1%的Ⅰ型胶元酶，37℃振荡消化60min。

1700r/min离心15min，观察液体分层，有细胞沉淀，弃上层脂肪及上清，PBS洗涤两次。

加入含10%的胎牛血清高糖-DMEM重悬细胞，用200目尼龙细胞筛将未消化的基质过滤去除。

调整细胞密度为2×109L-1接种于25cm2培养瓶内，在37℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度CO2孵箱培养。

48h首次全量换夜，以后隔天换液。

细胞至80%-90%融合时，用0.25%的胰酶消化3-5min，随时在倒置显微镜下观察细胞回缩变圆，加适量FBS终止消化，用吸管沿瓶底轻轻吹打，1200r/min离心弃上清，以1∶3比例传代。

2.ADMSCs的鉴定：

ADMSCs的形态学观察：

在倒置显微镜下观察常规培养原代的ADMSCs3，5，7d，第1，2，3，4，5及15代形态学变化并与诱导后的ADMSCs比较。

表面CD分子的检测：

取接近融合的第3代兔脂肪间充质干细胞，用2.5g/L的胰酶消化后，收集细胞，用pH7.2的PBS液洗涤2次，离心，将沉淀细胞用100μl流式缓冲液重悬，分别加入鼠抗兔PE标记的CD29、34抗体，4℃避光孵育45~60min，流式缓冲液洗涤；1%多聚甲醛固定。

然后用流式细胞仪（FASCCalibar，BD公司）检测细胞表面CD29，CD34。

MTT法检测细胞生长曲线：

常规培养和诱导培养的脂肪间充质细胞以104/孔接种到7块96孔板，复4孔，每天测1板。

测时吸出培养基，每孔加20μLMTT，在孵箱孵育4h,加150μLDMSO振荡10min，酶标仪490nm检测吸光度值。

3.ADMSCs诱导成骨的实验分组：

取生长状态好的第3代ADMSCs。

高密度诱导组按高密度微团培养法调整细胞密度为1010L-1,20μL/滴滴入置玻片的24孔培养板，细胞滴间距约1cm，在CO2孵箱孵育5h后，缓慢加入诱导培养基（1%FBS、H-DMEM、10μg/LTGF-β1、50μg/LIGF、100μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素）。

每隔2d全量更换诱导