酶切和胶回收的实验报告.docx

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酶切和胶回收的实验报告

题目：

目的基因双酶切和电泳纯化胶回收

一．实验目的:

1.学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法；

2.练习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

3.学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。

二．实验原理

1.限制性核酸内切酶：

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。

2.切割序列：

（1）BamHⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：

5'⋯G↓GATCC⋯3'→5'⋯GGATCC⋯3'

3'⋯CCTAG↑G⋯5'→3'⋯CCTAGG⋯5'

（2）EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：

5'⋯G↓AATTC⋯3'→5'⋯GAATTC⋯3'

3'⋯CTTAA↑G⋯5'→3'⋯CTTAAG⋯5'

3.为什么要选择表达载体质粒pET-28a？

pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。

充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。

4.限制性内切酶的选择：

选择BamHI、NotI两个位点

由于实验中须将质粒pEGFP-N3上所需的目的基因切下并连接到载体质粒pET-28a上，所以选择的限制酶需满足以下几个要求：

一．选择两种在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有酶切位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和载体质粒分别都有两个不同的末端，这样可以防止：

（1）质粒和目的基因的自身环化；

（2）质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；

（3）质粒与目的基因反向连接）

二．两种限制性内切酶的酶切位点需满足：

（1）不破坏目的基因；

（2）在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有且只有一个酶切位点；

（3）在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏载体质粒的启动子等关键序列。

载体质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图：

图一、pET-28a的酶切位点示意图图二、质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图

图三、pEGFP-N3MCS多酶切位点示意图

5.琼脂糖凝胶回收

（1）在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好方法就是进行琼脂糖凝胶电泳；

（2）不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离，通过回收可用于后续实验；

（3）本次实验使用试剂盒进行胶回收，按说明书进行操作，可以用溶剂使琼脂糖融化，再经过吸附管吸附目标DNA，冲洗，溶解后得到高纯度的目的基因片段。

（4）硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，使用弱碱溶液如TE（pH8.0）等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段；

三．实验材料及设备

1.实验材料：

已经提取好的pEGFP-N3质粒，1.5ml塑料离心管若干，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等），锥形瓶，一次性手套

2.实验仪器：

（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，移液枪头若干，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；

（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.实验试剂：

（1）目的基因的双酶切

a.核酸外切酶:

NotⅠBamHⅠ酶（置于冰盒中）

b.10×buffer（withBSA），ddH2O

（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测与纯化

a.geneGreen（DNA染料）

b.1×TAE缓冲液

c.上样缓冲液（6LoadingBuffer）

（3）胶回收目的基因片段

a．胶回收试剂盒一套，ddH2O

四．实验方法及步骤

1.目的基因双酶切

a）分别取两支0.2mlEP管做上记号：

如①②；

①EP管

②EP管

10×buffer

（withBSA）

2μL/

3μl+3μlddH2O

10×buffer

（withBSA）

2μL/

3μl+3μlddH2O

NotⅠ

1μL

NotⅠ

1μL

BamHⅠ

2μL/2μL

BamHⅠ

2μL/2μL

pET-28a

15μL/20μL

pEGFP-N3

15μL/20μL

b）两个EP管中分别配置下列的20（老师提供）/30μL（自提）体系：

（本次实验使用20μL体系）

c）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37度酶切1h；

d）酶切体系（20μL+4μlLoadingBuffer/30μL+6μlLoadingBuffer）全部加入点样孔进行电泳（自行配制40ml1%电泳凝胶液做胶），MarkerDNA加5μl，电泳结束后对目的基因片段进行胶回收。

切胶前请先称量装胶的1.5ml离心管重量并做记录，标记好离心管，装胶后在进行称量，算出胶的重量；

e）切胶时，带好护目镜。

在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片段，亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称重。

f）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需目的基因片段；

g）将提取好的目的基因上交保存；

2.DNA琼脂糖凝胶电泳检测

a）琼脂糖凝胶板的制备

b）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解;

c）待胶液冷却到65度（不烫手为宜），加入1μLGenegreen混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内,静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子;

3.加样

酶切体系（20μL+4μlLoadingBuffer/30μL+6μlLoadingBuffer）全部加入点样孔进行电泳（自行配制40ml1%电泳凝胶液做胶），MarkerDNA加5μl

4.电泳

将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

5.观察和拍照

将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

五．

实验结果

图1双酶切体系处理pEGFP-N3与pET-28a质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果

说明：

从左到右依次为：

pET-28a、pEGFP-N3、DL15000Maker、pEGFP-N3、、DL15000Maker

由图可知，pEGFP-N3泳道呈现为十分清晰的双条带，上部为酶切后的pEGFP-N3质粒，下部为目的基因片段，无拖影，无杂带，说明目的基因纯度较高，数量较多，前一实验提取的质粒纯度较高。

与Marker比照，酶切理论上会产生约4000bp和约800bp的条带，预期分子量基本符合对应的分子量条带，实验结果较好。

pET-28a泳道共产生了四条条带，除了最上层清晰的5000bp条带，还应该出现30bp的条带，但该条带由于分子量太小，很有可能已经脱出琼脂胶，无法在结果上显示，所以另外的三个条带推测为前一次实验提纯质粒时混入的RNA或其他杂质。

切胶时，带好护目镜。

在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片段，亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称重结果为约1.1g。

胶回收完成后，得到少量溶有目的基因片段的PE管一支。

六．结果讨论与结论：

1.实验结论：

根据琼脂糖电泳紫外荧光检测结果可见，各泳道拖影现象不明显，pEGFP-N3泳道条带清晰，无扭曲现象，无杂带，酶切结果较好；pET-28a泳道由于只是切开一个缺口，理论上只应该有一个清晰条带，实验结果符合预期。

和Marker对照分子量符合理论结果，实验结果良好，可继续用于下一次实验。

2.讨论一：

影响酶切效率的因素有哪些？

答：

DNA的质量，限制性内切酶活性，酶的用量，酶切时间，酶切温度，缓冲液的条件

3.讨论二：

在实验操作中，取用酶试剂时操作应注意哪些方面？

答：

（1）放在冰上使用，让酶一直处于低温环境，保持活性；

（2）取用不同的酶时要换新枪头，不要污染酶试剂。

4.讨论三：

实验操作中，怎样能使微量的试剂混合均匀？

答：

（1）加入试剂时，尽量在管底部加入；

（2）可进行瞬时离心。

5.讨论四：

本次实验酶切结果较好，可能是哪些原因？

答：

（1）在酶切之前，轻柔混匀酶与质粒多次，加快反应，提高效率；

（2）适当延长酶切的时间，保证反应的完成度。

（3）前一次提取的质粒数量和质量较高，提高了本次实验的成功率。

6.讨论五：

胶回收时的注意事项？

（1）检测时用小梳子，减少损耗

（2）回收提纯时用大梳子，提高效率

（3）称取胶的重量，是为了确定PC溶液的质量，避免浪费和其他不可预知的影响。

（4）用平衡液处理吸附柱，直接影响后续的实验结果，因为回收柱的盐浓度、酸碱度（电荷）和疏水性使对DNA与柱子结合有着决定性的作用；衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温、潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响；如果胶回收的吸附柱没用平衡液BL进行处理，吸附柱的吸附能力就不高，就会降低回收DNA的效率。

七．参考文献：

[1]魏群．《分子生物学实验指导》（第三版）

[2]朱玉贤，李毅，郑晓峰，郭红卫．《现代分子生物学》（第4版）．高等教育出版社．2013,1