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乳酸细菌胞外多糖的研究
LANZHOUUNIVERSITYOFTECHNOLOGY
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乳酸细菌胞外多糖的研究
摘要
乳酸细菌(LAB)胞外多糖(EPS)是乳酸细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的的荚膜多糖和粘液多糖的总称。
本实验采用酶解法从乳酸细菌发酵液中提取胞外多糖。
通过测定胞外多糖的含量筛选出了2株高产胞外多糖的菌株,并运用单因素及正交实验对其发酵条件进行优化,优化后的最佳发酵条件是:
初始培养基pH5.5,乳糖添加量为20g/L,接种量为5.0%,发酵温度为37℃,发酵时间为24h。
最后,利用薄板层析法测定多糖样品中含有的单糖,初步确定有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖,多糖的抗氧化性研究结果表明,保加利亚乳杆菌多糖样品液具有体外清除O2-·和·OH的作用,在所作实验范围内其最大清除率分别为68.7%和69.4%。
关键字:
乳酸细菌胞外多糖薄板层析发酵条件氧化性
Abstract
Lacticacidbacteria(LAB)extracellularpolysaccharide(EPS)issecretedbythenameoflacticacidbacteriafromthecellwallofthegenericcapsularpolysaccharideandmucuspolysaccharidesintheprocessofgrowthandmetabolism.Theexperimentsonextractionofexopolysaccharidesfromlacticacidbacteriainthefermentationbrothbyenzymaticmethod.Bydeterminationofextracellularpolysaccharidewerescreenedout2strainsofpolysaccharidehigh-yieldextracellular,andthefermentationconditionsoptimizationofsinglefactorandorthogonalexperiments,theoptimumfermentationconditionsoptimizationis:
initialculturepH5.5,lactoseconcentrationis20g/L,inoculum5%,fermentationtemperature37℃,fermentationtimewas24h.Finally,determinationofmonosaccharidescontainingpolysaccharidesamplesofglucose,galactose,rhamnoseandmannosebythinlayerchromatography,antioxidantactivityofpolysaccharidesshowedthat,LactobacillusbulgaricuspolysaccharideliquidsampleswithscavengingO2-·and·OHroleintheexperimentalrange,themaximumclearancerateswere68.7%and69.4%.
Keywords:
lacticacidbacteriaExtracellularpolysaccharideThinlayerchromatographyFermentationconditionsOxidation
目录
一、综述1
(一)乳酸细菌胞外多糖的介绍1
1.乳酸细菌EPS的分类、化学组成和结构1
2.乳酸细菌EPS的物理学特性:
1
3.乳酸细菌EPS的生理学特性2
(二)多糖的提取方法研究3
1.碱提法3
2.酶解法3
(三)国内外研究现状4
(四)研究目的及意义4
二、材料与方法4
(一)材料4
1.仪器4
2药品与试剂5
3.菌株5
4.主要培养基5
(二)方法5
1.试剂的配制5
2.菌种的活化5
3.酶解法提取胞外多糖6
4.多糖的纯化6
5.胞外多糖(EPS)含量的测定6
6.单因素及正交实验优化发酵条件6
7.薄板层析法(TLC)分析多糖的单糖组成7
8.多糖抗氧化性的测定7
三、结果与分析8
(一)葡萄糖标准曲线8
(二)胞外多糖产量8
(三)单因素及正交实验优化发酵条件8
1.碳源的影响8
2.乳糖添加量的影响9
3.接种量的影响9
4.pH的影响10
5.培养时间的影响11
6.培养温度的影响11
7.正交实验和验证实验12
1.单糖的展层效果13
2.多糖的展层效果13
(五)多糖抗氧化性的测定14
1.超氧阴离子自由基(O2-)清除作用:
14
2.羟基自由基(·OH)的清除作用:
15
四、讨论15
五、结论16
参考文献16
一、综述
微生物的生长通常伴随着胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)的产生。
EPS具有特殊的生物学功能,它粘合在细胞表面,可以作为细胞膜的保护屏障,也可以作为生物膜的组成成分[1]。
黄原胶、硬葡聚糖、结冷胶、热凝多糖、右旋糖苷、短梗霉多糖、细菌纤维素等都属于胞外多糖,它们已经成功地应用于食品、医学、制药、化妆品及石油行业中。
乳酸细菌胞外多糖是乳酸细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物,有的依附于微生物细胞壁形成荚膜,称为荚膜多糖(CPS);有的进入培养基形成粘液,称为粘液多糖(SPS),是微生物次级代谢产物。
乳酸细菌EPS有很多功能,如保护细胞体、作为胶黏剂与其他细菌表面相互作用、用作抵御环境的保护因子,在生物膜中起到结构稳定剂的作用等。
乳酸菌EPS的结构多样性使其具有一系列的物理化学和生物学特性。
(一)乳酸细菌胞外多糖的介绍
1.乳酸细菌EPS的分类、化学组成和结构
(1)乳酸细菌EPS的分类:
迄今为止,大多数已报道的产EPS乳酸细菌能代谢产生SPS,但部分乳酸细菌可同时产生CPS和SPS。
按伯杰氏系统细菌学手册中的生化及形态分类法,乳酸细菌分为18个属[2],目前对其中几个属包括乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococeus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)等乳酸细菌的胞外多糖研究较多。
从化学组成上讲,EPS又可以进一步分为两种类型:
一种是同型多糖(HoPS),由三个或以上的同种单糖构成,如葡聚糖、果聚糖、半乳聚糖等。
它是在细胞外或细胞壁上以蔗糖为糖基供体聚合而成的。
另一种是杂型多糖(HePS),即结构重复单元由不同的单糖组成,每个重复单元由3-8个单糖、单糖衍生物或取代单糖组成。
它由细胞内的糖基-核苷酸作为前体分子,并在细胞膜上聚合而成,最后释放到细胞体外。
(2)乳酸细菌EPS的化学组成和结构:
对于乳酸菌生长过程中产生的EPS的化学组成,研究学者开始认为这类黏性物质是糖蛋白或者是碳水化合物—蛋白质的复杂化合物。
后来经过大量的研究,逐渐发现这类黏性物质是由许多带有分支的重复单位构成的多糖。
来自于乳酸细菌的HoPS分子量在4.0×104∼6.0×106之间,可以分为以下四类[2]:
①α-D-葡聚糖,其中有葡萄糖残基以α-1,6键连接,同时在α-1,3位有不同程度的分支、少部分在α-1,2位和α-1,4位出现分支。
②β-D-葡聚糖,葡萄糖残基以β-1,3键连接,在β-1,2处出现分支的结构。
③β-D-果聚糖,果糖残基以β-2,6键连接,在β-2,1处出现分支的结构。
②其他,聚半乳糖,由结构一致的重复单体以不同的糖苷键连接而成的。
HePS分子量在4.0×104~6.0×106之间,与HoPS相比结构更为复杂。
HePS由分支(在C2,C3,C4或C6)或无分支的重复单元组成。
乳酸细菌HePS重复单元的组成成分有单糖,单糖衍生物和取代单糖。
不同的HePS,其重复单元中的单糖种类和连接方式也不同。
通常有D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖,有时也会出现其他戊糖和己糖,如D-甘露糖,D-蔗糖,L-岩藻糖,D-木糖和D-阿拉伯糖。
少数EPS中还存在N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸,有时在非糖残基中可能存在其他基团如磷酸基、乙酰基和甘油等。
这些单糖多以α-键或β-键连接的吡喃或呋喃糖的形式存在。
EPS的一级结构决定了它的高级结构,其结构层次分类与蛋白质大致相同,也可以分为一级、二级、三级、四级结构。
EPS的二级结构是指多糖的骨架链内以氢键结合所形成的聚合体,即多糖分子的主链构象并不涉及侧链的空间排布。
二级结构进一步卷曲、折叠形成特定构象的三级结构。
多糖的四级结构是多糖链间的相互协同结合,即亚单位现象。
由于乳酸菌EPS的种类繁多、结构多样,目前对于其结构及与功能的关系的报道还相对较少。
2.乳酸菌EPS的物理学特性:
乳酸细菌具有公认的安全性(generallyrecognizedassafe,GRAS),在乳制品或其他发酵产品中有着广泛的应用。
目前,除了右旋糖酐外,还未见有其他乳酸菌EPS商业化生产。
乳酸细菌EPS作为乳酸菌在乳制品如酸乳、干酪发酵代谢产生的天然产物,对乳制品的品质有着重要的影响。
同时,乳酸细菌EPS还具有良好的保健功能。
由于乳酸细菌EPS具有独特的物理学和生理学特性,使其在酸乳干酪生产,保健食品的开发及医药等方面有着巨大的应用潜力。
hk发酵乳的重要结构特征是其硬度和持水力,这些特性和它的凝胶结构有关。
发酵乳微观结构显示,在细胞表面和乳蛋白网络之间存在胞外多糖,EPS可以干扰酪蛋白在凝胶过程中与其他不稳固凝结物的结合。
为了研究EPS对发酵乳黏度的影响,Ayala-Hernandez等[3]从Lactococcuslactissubsp.cremorisJFR1发酵液中分离纯化得到EPS,并将其加入到发酵乳中,调节pH到5.6和6.7,在不同时间段取样,并在4℃下放置6h后测定黏度,研究结果表明随着EPS含量的提高,发酵乳的黏度也有显著的提高,而pH未对黏度产生显著影响。
Purwandari等[4]在不同温度下用产EPS菌株S.thermophilus发酵牛乳,发现EPS的含量对发酵乳的质构没有显著影响。
Perry等[5]研究了产EPS乳酸细菌发酵剂对低脂Mozzarella干酪的水分和融化特性的影响,研究发现产EPS的发酵剂可以提高干酪的保水性和产量,改善干酪质构。
多项研究表明乳酸细菌EPS影响发酵乳的流变学特性,因此研究者普遍认为酪蛋白在随pH降低而凝固时与EPS之间的相互作用是影响凝乳质构的关键所在。
由于乳酸菌EPS具有独特的流变特性,可作为稳定剂、凝胶剂、增稠剂在食品中使用。
3.乳酸细菌EPS的生理学特性
(1)乳酸细菌EPS的抗肿瘤作用:
近几十年来,由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发,新的微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。
由于乳酸细菌是食品级工业生产菌,与其他菌相比安全性高,所以近年来对乳酸细菌胞外多糖的研究逐渐增多。
但产量低,菌株稳定性差,仍是制约其大规模生产的主导因素。
现在各国科学家试图用基因工程的手段构建高产菌株,但至今仍没成功。
胞外多糖具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡,可应用于医药领域。
刘慧等[6]从藏灵菇中筛选出产EPS的干酪乳杆菌KL1,并研究了其纯化后的EPS对人结肠癌细胞HCT-8的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。
用CCK-8法检测细胞活力,结果表明EPS能有效降低HCT-8的活力并抑制其增殖,且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖性。
用AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡情况,表明EPS处理组的阳性细胞明显高于对照组,由此判断EPS可诱导HCT-8细胞凋亡的发生,从而抑制HCT-8细胞的增殖。
冯美琴等[7]研究发现植物乳杆菌70810产生的EPS-1和EPS-2对体外培养的大肠癌细胞HT-29的增殖均具有明显的抑制作用,随着EPS浓度的增加,抑制率逐渐增大。
阳性对照5-Fu在50μg/mL时,对肿瘤细胞的抑制率达到68.51%但组分EPS-2的抑制率明显高于EPS-1,原因可能与其结构参数如分子质量、单糖组成等有关。
van等[8]从Lb.plantarumNRRLB-4496中分离得到一种以β-(1→4)和β-(1→6)键连接而成的葡聚糖,发现它在体外可以抑制六种癌细胞(肠道癌细胞CACO、宫颈癌细胞HELA、结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞HEPG2、乳腺癌细胞MCF7、喉癌细胞HEP2)的生长,其半抑制浓度分别为9.07、15.8、17.6、19.9、24.2、34.7μg/mL。
并可以抑制小鼠体内欧利希氏腹水癌细胞的生长,小鼠的平均存活时间延长了88.9%。
(2)乳酸细菌EPS的抗氧化作用:
自由基和脂质过氧化产物是引起氧化损伤的重要原因,自由基的清除、抑制脂质氧化也是评价抗氧化性的重要指标。
大量研究表明,一些乳酸细菌EPS具有抗氧化作用。
许女等[9]研究了干酪乳杆菌KW3产生的EPS抗氧化活性,体外试验表明,当EPS浓度为200μg/mL时,其对DPPH自由基的清除率为37.53%,FRAP值为(600.16±15.23)FeSO4·7H2Oμmol/L体内抗氧化试验显示EPS可显著降低衰老小鼠血清、肝和脑组织中的MDA含量,提高其SOD和GSH-Px活性。
颜炳祥等[10]研究了硒化的EPS抗氧化活性,结果表明硒化的EPS总抗氧化能力及对羟自由基的清除能力增强,而对超氧阴离子自由基的清除能力变化不大。
孟祥升等[11]研究发现副干酪乳杆菌H9产生的EPS抗氧化能力随浓度升高而增强,当EPS浓度达到200mg/L时,其对羟自由基、超氧自由基和DPPH自由基清除率分别为(55.3±1.5)%、(68.7±1.1)%和(70.8±0.6)%。
(3)乳酸细菌EPS的免疫调节作用:
近些年,有关乳酸菌EPS的免疫调节作用已成为研究的热点。
刘佳等[12]研究了硒化乳酸菌胞外多糖(Se-EPS)对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响,结果显示Se-EPS能够显著增强体外巨噬细胞的吞噬活性,提高NO和TNF-α的分泌量(NO可杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞等,同时在炎症损伤方面起着十分重要的作用;NF-α是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一,且可作为免疫的第一介质),并且在Se-EPS浓度为50~1000μg/mL之间呈浓度依赖性增加。
说明Se-EPS有助于促进巨噬细胞的细胞介导免疫反应,增强免疫调节作用。
Ruas-Madiedo等[13]研究发现Bifidobacteriumanimalisssp.lactisA1、IPLA-R1、BifidobacteriumlongumNB667和Lb.rhamnosusGG代谢产生的EPS在1μg/mL时可以抵御体外真核细胞的细胞毒素,保护人体免受病原体侵害。
乳酸菌EPS可作为益生元加以利用。
益生元是一类非消化性的物质,但可作为底物被肠道正常菌群利用,能选择性刺激结肠内一种或几种细菌生长,对宿主健康起到有益作用。
Looijesteijn等[14]对Lactissubsp.cremorisNZ4010产生的胞外多糖的不可消化性进行了研究,用含EPS的饲料对老鼠进行体内试验,发现在老鼠粪便中的胞外多糖接近100%,由此表明胞外多糖在肠道中没有消化。
目前主要应用的益生菌(乳杆菌和双歧杆菌)都能够产生EPS,因此乳酸菌及其发酵制品的生理功能可能归功于其细胞壁的成分,尤其是EPS。
乳酸菌EPS也可以促进菌体在肠粘膜上的非特异性粘附作用,其中CPS使菌体更容易在肠道内定植EPS由于能够增加食品的粘度,使得发酵乳制品可以再在胃肠道内的存留更长的时间,对益生菌在肠道内的作用十分有益。
所以对于一株高产具有良好粘附性的EPS的益生菌来说,更具有应用价值。
(4)其他:
乳酸细菌EPS对细胞体有着保护作用,它有助于细胞抵御不良环境、免受毒害、便于菌体附着在固体表面。
研究发现SPS可保护细菌免受机械力的破坏以及抗菌物质破坏细胞。
菌体在干燥、高温或冷冻等极端条件下,可以利用具有高亲水性的胞外多糖间质存留的水保护菌体。
当菌体遭遇外源病原物的侵袭时,外膜包被着具有粘液状的EPS能够有效保护菌体免受病原物或噬菌体的识别或吞噬。
此外,乳酸菌EPS还具有降血压、降血脂、降胆固醇、缓解乳糖不耐症、抑制有害微生物和预防腹泻等功能特性。
产胞外多糖对乳酸菌而言是一种显著的耗能行为。
目前,对乳酸菌胞外多糖的生理作用尚不完全清楚。
一般认为,胞外多糖具有保护作用,如形成亲水表面防止细胞干裂、螯合重金属离子防止其毒害、使噬菌体不敏感从而防止其侵害、防止抗菌素破坏(抗菌素必须在胞外多糖中达到饱和以后才能到达细胞壁)、提供高氧张力等。
此外,胞外多糖还参与金属离子吸收、营养物转运、致病性识别、起粘合作用及作为储备碳源等。
由突变链球菌和唾液链球菌所产的突变聚糖(mutan)及果聚糖在龋齿的形成中起重要作用,这两种水不溶性多糖的粘合作用使致龋齿菌得以依附于牙齿上。
(二)多糖的提取方法研究
1.碱提法
多糖在碱性溶液中稳定,例如粘多糖的提取多采用碱提取法[15].张兰杰[16]等在70℃条件下,将五味子用稀NaOH溶液调pH8,水溶液提取3次,滤液浓缩、醇析、Savage法脱蛋白、脱脂、脱色、DATE纤维素柱洗脱等步骤,分离出两种多糖组分,质量分数分别为0.387%和0.061%.田龙[17]以豆渣为原料,在碱性条件下脱蛋白,再用质量分数为30%氢氧化钠溶液在45℃提取90min,以干豆渣计算,水溶性大豆多糖提取率为48%.碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味和色泽.
2.酶解法
酶解法指的是使用酶来提取多糖,从而提高提取率的生物技术.其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等.蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用,使其结构变得松散;蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解,有利于多糖的浸出.谢红旗等[18]采用中性蛋白酶解法提取香菇多糖,和直接水提法比较,结果表明在pH4.8,温度50℃,处理时间60min,多糖得率增大40%,杂质蛋白质减少50%.张文超等[19]对金针菇多糖的酶法提取进行了研究,采用木瓜蛋白酶,最佳提取条件为:
温度60℃,pH6.5,酶添加量为原料体积的2%,提取时间2h.在最佳提取条件下金针菇多糖的提取率为20.32%.纤维素酶则能特异性地降解纤维素,使植物细胞的细胞壁破裂,多糖易从胞内释放。
此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。
(三)国内外研究现状
近年来,乳酸细菌(LAB)胞外多糖(EPS)的研究与开发越来越引起学者的关注。
目前研究的大多数产胞外多糖的乳酸细菌来自于乳制品,也能从发酵肉制品中分离到。
王静颖等[20]从保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的牛乳培养物中提取胞外多糖并进行了纯化。
陈营、孙莉萍等应用苯酚硫酸法对干酪乳杆菌胞外多糖产生的影响因素进行了研究。
虽然产生胞外多糖的乳酸细菌研究较多,但真正有价值并已商品化的胞外多糖却很少。
除菌种的本身因素外,胞外多糖的产量又受许多因素的影响。
由于国内对乳酸细菌胞外多糖的研究报道不多,多数的乳酸细菌胞外多糖还处于研究开发阶段[21]。
葡聚糖明串株菌生产的葡聚糖由于转化率高,成本相对较低,已经用于食品生产的许多方面。
但对大多数乳酸细菌胞外多糖而言,其转化率低,生产成本相当高,要在工业上应用还待进一步的研究,提高EPS的产量,拓宽EPS潜在的应用范围。
总结多年来国内外有关的研究概况,现阶段主要集中于影响EPS的生物合成条件的研究。
乳酸细菌EPS的多种生物学功能,吸引了各个领域的学者,国际上EPS专题会议已经进行了多次研究。
EPS已广泛应用于食品、医疗等各个领域。
利用产EPS的乳酸细菌生产酸奶可改善产品的流变学特性,同时可不再使用被限定的稳定剂。
近年来,有关乳酸细菌全基因组或部分基因组序列的提出,为乳酸细菌的遗传学、生物化学和生物学分析提供了更多的依据和信息,结合多糖合成代谢途径调控,可以生产具有特定用途的EPS[22]。
(四)研究目的及意义
微生物多糖除了对细菌自身有生物学意义外,更重要的是它具有安全无毒,理化性质独特,用途广泛,易于菌体分离及通过深层发酵实现工业化生产等优良特性而备受关注。
与植物多糖相比,微生物多糖的生产周期短,不受季节,地域和病虫害条件的限制,具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景,越来越受到人们的关注,它在很大程度上能够满足人们对天然无公害食品的需求。
随着生产技术的不断提高,微生物多糖在工业中的应用范围将不断拓宽。
本文围绕乳酸细菌EPS,利用酶解法生产EPS,通过测定其EPS含量筛选出1到2株高产EPS的菌株,并且运用单因素及正交实验对其发酵条件进行优化。
最后,利用薄板层析法测定多糖的单糖组分,并且测定多糖的抗氧化性。
二、材料与方法
(一)材料
1.仪器
表1主要仪器及型号
仪器名称
型号
生产厂家
紫外分光光度计
UV-9200
北京瑞利分析仪器公司
分析天平
AB104-N
梅特勒仪器(上海)有限公司
超净工作台
JJ-CJ-ID
杭州净化设备厂
电热恒温干燥箱
HPX-9162MBE
上海博讯实业有限公司
水浴锅
HH-2
江苏省金坛市医疗仪器厂
生化培养箱
SPX-100B-Z
上海博讯实业有限公司
恒温振荡培养箱
BS-2F
江苏省金坛市医疗仪器厂
手提式电热压力灭菌锅
XYQ-SG46-280S
上海博讯实业有限公司
电炉
1KW单联
北京科伟永新仪器有限公司
循环水式多用真空泵
SHB-ⅢA
郑州长城科工贸有限公司
表2主要玻璃仪器及规格
仪器名称
仪器规格
三角瓶
100mL、250mL
移液管
0.5mL、1mL、5mL、10mL
比色管
10mL
烧杯
250mL、500mL
量筒
500mL、100mL
离心管
50mL
2药品与试剂
表3主要药品与试剂及生产厂家
药品与试剂名称
生产厂家
氢氧化钠
天津市德恩化学试剂有限公司
葡萄糖
上海化学试剂厂
乙醇
天津百世化工有限公司
磷酸氢二钾
天津百世化工有限公司
氯化钾
天津开发区海光化学制药厂
氯化钠
天津开发区海光化学制药厂
盐酸
天津市东方化工厂
抗坏血酸
天津市德恩化学试剂有限公司
蛋白胨
北京双旋微生物培养
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