谈HPLC法测定接骨定痛丸中士地宁的含量.docx
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士地宁是马钱子中的一种生物碱,马钱子始载于《本草纲目》,系《中国药典》收载品种。
士地宁是一种剧毒成分,也是具有生理活性的成分。
用于偏瘫、瘫痪及因注射链霉素引起的骨骼肌松弛、弱视症等。
试用于白细胞减少症和再生不良性贫血,有一定的疗效。
近年研究发现士地宁对脊髓、延髓、大脑皮质等神经系统及消化系统有一定的药理作用。
过量可使中枢兴奋作用增强,导致全身骨骼肌挛缩,以至发生强直性惊厥。
本文采用HPLC法测定接骨定痛丸中士地宁的含量,是控制其质量的重要环节。
1仪器与试药
HPLC1100(安捷伦):
二元泵,紫外检测器,自动进样器;士地宁对照品(中国药品生物制品检定所批号:
110705~200306,纯度为97%);样品由吉林省德惠市万宝镇骨伤医院提供批号:
070901,070902,070903(规格每丸9g);乙腈为色谱醇,庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾为分析纯;实验用水为超纯水。
2方法与结果
对照品溶液及样品溶液的制备
士地宁对照品溶液:
精密称取士的宁对照品10mg,置25mL量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度,摇匀。
分别精密量取3mL,置25mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得(每1mL中含士的宁mg)。
样品溶液制备:
取重量差异项下的本品适量,剪碎,取约11g,精密称定,加浓氨试液3mL混匀,放置30min,精密加入三氯甲烷50mL,密塞,称定重量,置水浴中回流提取2h,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失的重量,摇匀,精密量取续滤液20mL,置分液漏斗中,用硫酸溶液(3→100)提取5次,每次15mL,合并硫酸液,加浓氨液调节pH值至9~10,用三氯甲烷提取5次每次20mL,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣用甲醇溶解后,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
阴性对照样品溶液的制备:
按处方制备不含马钱子粉的阴性对照样品,按样品溶液制备方法制成相应的阴性样品溶液,精密量取溶液10μL,注入液相色谱仪,色谱图无相应的吸收峰。
溶剂空白试验:
取含量测定项下所用的溶剂甲醇,按正文色谱条件测定。
测定结果,在与士的宁相应的保留时间附近无干扰峰检出。
色谱条件与系统适用性试验。
色谱柱:
AglilentSBC18柱;流动相:
A:
mol/L庚烷磺酸钠与mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值),B:
乙腈,A∶B(21∶79)为流动相;检测波长为260nm;柱温为30℃;流速为mL/min;进样量10μL。
理论板数按士的宁峰计算应不低于3000。
士的宁与相邻杂质峰分离度>。
在此条件下,溶剂空白、阴性对照、对照品和样品色。
线性关系考察:
精密称取士的宁对照品10mg,25mL量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度,摇匀。
分别精密量取3mL,置25mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得,作为对照品溶液(每1mL中含士的宁mg)。
精密吸取、、、10、15、20μL,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。
以峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,测得回归方程为Y=+,相关系数r=(n=6)。
结果表明,士的宁进样量在~ng范围内,具有良好的线性关系。
精密度试验:
精密量取系统适用性试验项下供试品溶液10μL,注入液相色谱仪,连续测定6次,RSD为%,重复性试验结果结果表明,本法精密度良好。
最低检测限测定:
按信噪比等于3(S/N=3),作为最低检测限,测得接骨定痛丸中士地宁的检测限为48ng/mL。
重现性试验:
取同一批号的样品,精密称定6份,分别依法提取制成供试液。
按正文方法测定其含量。
RSD为%,重复性试验结果结果表明,本法精密度良好。
稳定性试验:
照系统适用性试验项下制备供试品溶液,每隔2h进样测定一次,共测定12h,计算含量,RSD为%,稳定性试验结果,供试品溶液在12h内基本稳定。
2.8供试品回收率试验:
精密称取批号为070901(已知含量mg/g)的样品6份,每份约10g,分别精密加入对照品贮备液(mg/mL)mL按正文方法制备及测定,计算加样回收率,测得6次平均回收率为%,RSD为%,试验结果表明:
供试品回收率较高,RSD在规定范围内。
HPLC法测定金钱白花蛇药酒中士的宁与马钱子碱的含量
HPLC金钱白花蛇药酒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册;处方由白花蛇、乌梢蛇、制马钱子、五加皮等十四味组成;具有祛风除湿,散寒止疼,活血通络,舒筋强骨之功效。
其现行标准〔含量测定〕项采用酸碱滴定法测定制马钱子中士的宁的含量,该方法操作繁琐,干扰因素多,准确性差。
为保障用药安全,有效地控制药品质量,我们参考《中国药典》2010年版马钱子项下方法,建立了高效液相色谱同时测定金钱白花蛇药酒中士的宁与马钱子碱含量的方法。
1仪器与试药
日本岛津LC-30A液相色谱仪,SPD-M20A二极管阵列检测器(DAD)。
士的宁(批号110705-200306,纯度97%)、马钱子碱(批号110706-200505,纯度95.9%)对照品均购自中国食品药品检定研究院;金钱白花蛇药酒(生产企业提供,共19批次);乙腈为色谱级(德国默克公司),水为超纯水,其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验
色谱柱为Shim-packVP-ODSC18(4.6mm×150mm,5μm);以乙腈-0.02mol·L-1磷酸二氢钾与0.01mol·L-1庚烷磺酸钠等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2.8)(19∶81)为流动相;流量1.0mL·min-1检测波长260nm;柱温35℃;进样体积为5μL。
理论板数以士的宁峰计算应不低于2000。
2.2对照品溶液的制备
取士的宁对照品约20mg,精密称定,置25mL量瓶中,加三氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀;取马钱子碱对照品约12mg,精密称定,置10mL量瓶中,加三氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀。
分别精密量取上述溶液各1mL,置同一10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得(纯度按100%折算后每1mL中含士的宁80μg,马钱子碱120μg)。
2.3供试品溶液的制备
精密量取供试品25mL,置锥形瓶中,置水浴上挥至约10mL,放冷,加氢氧化钠试液5mL,混匀,放置30min,定量转移至分液漏斗中,用三氯甲烷振摇提取3次,每次25mL,合并三氯甲烷液,蒸干,用三氯甲烷3mL溶解,转移至25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
2.4专属性试验
按照处方比例和工艺制备缺制马钱子的阴性样品,按“2.3”项下的方法制成阴性对照溶液。
分别精密对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5μL,注入液相色谱仪,依法测定。
结果表明阴性对照无干扰。
A.混合对照品;B.供试品;C.阴性对照图1专属性试验HPLC色谱图。
2.5线性关系考察
分别精密吸取士的宁对照品溶液(127.4μg·mL-1)与马钱子碱对照品溶液(130.4μg·mL-1)0.5,1,2.5,5,10μL,分别注入液相色谱仪,依法测定峰面积。
以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,计算标准曲线,其回归方程士的宁为Y=1601X+22479(r=0.9994),马钱子碱为Y=1944X+19585(r=0.9997)。
结果表明进样量士的宁在65.2~1304ng,马钱子碱在63.4~1274ng的范围内线性关系良好。
2.6精密度试验
精密吸取对照品溶液5μL,依法重复进样6次,测定峰面积,6次进样结果表明:
士的宁峰面积的RSD为0.4%、马钱子碱峰面积的RSD为0.3%,说明仪器进样精密度良好。
2.7稳定性试验
取供试品溶液,分别在制备的第0,2,5,8,12,24h依法进样测定峰面积,结果士的宁和马钱子碱峰面积的RSD值分别是0.76%和0.73%。
结果表明,供试品溶液在24h内基本稳定。
2.8重复性试验
取批号为20110603的供试品6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液并依法测定,以外标法计算含量,结果士的宁与马钱子碱平均含量分别为0.0877和0.1247mg·mL-1,其RSD分别为0.90%、1.28%,表明本法重复性良好。
2.9回收率试验
取批号为20110603的供试品(马钱子碱87.7μg·mL-1,士的宁124.7μg·mL-1)6份,每份精密量取15mL,精密加入含马钱子碱浓度为0.675mg·mL-1,士的宁浓度为0.923mg·mL-1的混合对照品溶液2mL,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定士的宁与马钱子碱的含量,根据结果分别计算士的宁与马钱子碱的加样回收率,见表1~2。
结果表明,该方法准确性良好。
3讨论
3.1提取方法比较及流动相的选择
士的宁与马钱子碱为吲哚类生物碱,易溶于三氯甲烷,故采用三氯甲烷作为提取溶媒,试验考察了25mL超声提取、25mL回流提取和萃取3次,每次25mL三种方式,结果表明萃取提取效率最高,故采用萃取提取方式。
同时对萃取次数(3次,6次)进行了考察,结果表明萃取3次即可完全提取。
分别考察了乙腈-水(含磷酸二氢钾-庚烷磺酸钠)、乙腈-磷酸(含三乙胺)等流动相系统,结果表明乙腈-水(含磷酸二氢钾-庚烷磺酸钠)系统结果较为理想。
3.2耐用性试验
试验采用三根色谱柱:
Shim-packVP-ODS柱(色谱柱编号228-34937-91)、Uitimate(色谱柱编号210701677)、Agilent(色谱柱编号USCL02371)测定同一批号(批号20110603)样品,士的宁和马钱子碱平均含量的RSD分别是0.70%和0.88%,表明不同型号的色谱柱对测定结果无明显影响。
试验还分别用Waters2690,岛津30A,、安捷伦1100等不同液相色谱仪进行测定,发现按药典方法[2]制备的对照品进样体积超过10μL时,峰型变差,峰面积会减小,导致线性曲线弯曲;而注入较小体积(如5μL)不同浓度的对照品,对照品线性关系良好。
原因分析:
可能是乙腈-0.02mol·L-1磷酸二氢钾与0.01mol·L-1庚烷磺酸钠等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2.8)(19∶81)为离子对流动相,对照品在溶解过程中为保证充分溶解又必须使用部分三氯甲烷,根据相似相溶原理,该流动相与对照品溶剂互溶性较差,注入大体积对照品溶液时,其与流动相难以完全互溶,从而导致线性关系变差,而注入小体积不同浓度对照品溶液则不存在此问题,故选择进样体积为5μL。
3.3小结
本研究建立了高效液相色谱同时测定金钱白花蛇药酒中士的宁与马钱子碱含量的方法。
该方法为企业在生产中控制制马钱子中的毒性成分士的宁与马钱子碱的含量提供了切实可行的方法,有利于保证药品的安全性及有效性。
样品的士地宁测定:
取样品10批,按正文方法进行测定,记录色谱图至柱峰保留时间的2倍,计算十批含量,RSD为%。
3讨论
马钱子有较明显的疗效,但因马钱子治疗剂量与中毒剂量较接近,不良反应较多,限制马钱子的广泛应用,目前对马钱子及提取物中主要成分的测定进行了广泛的研究,同时对复方药中马钱子也进行了研究,研究证明用试剂三氯甲烷,采用加热回流法提取完全。
本文采用,加热回流法提取,应用HPLC进行测定接骨定痛丸中士地宁的含量,实验表明色谱条件和系统适应性实验均符合,本方法灵敏度高,方便可行,可作为接骨定痛丸中马钱子的士地宁的含量测定方法,即控制其毒性和保证疗效。
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