PGM测序方法protocol.docx
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PGM测序方法protocol.docx
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PGM测序方法protocol
314芯片测序方法
文库构建:
PCR扩增基因组DNA的目标区域
1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。
对每一个DNA和引物池的混合,将以下组分加入PCR管内。
以下表格提供了包含和未包含IonAmpIiSeq™SampIeIDPanel的反应体系。
对多个反应可准备配置混合溶液。
2X引物池(Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels)
5X引物池(Cat.nos,4471262and4475346)
2.充分震荡,简单离心。
3.将PCR管賓.于PCR仪内,运行一下程序以扩增基因组上目标区域。
阶段
步骤
温度
时间
持续
酶活化
99°C
2分钟
循环数(根据下
变性
99°C
15秒
表格设置)
退火/延伸
60"C
4/8/16*分钟
持续
——
10°C
持续+
*4分钟是对W1536对引物池:
8分钟是对1537-6144对引物池:
16分钟是对
6145-24576对引物池。
+PCR产物可置于10°C过夜储存。
注意:
Ready-to-usepanels:
当加入IonAmpIiSeq™SampIeIDpanel时不需要调整彳盾环数。
Customprimerpools:
如果一个custom设计的panel中包含两个引物池,并分别落在不同的循环数分类中,请选用更大的循环数来扩増这两个引物池。
一般标准样品可以增加一个徧环,从而保证其扩增效率,石蜡切片样品可增加2-3个徧环。
暂停点-PCR产扬可以储存在10°C过夜,需要更长时间储存,可以置于・2(TC.
部分消化引物序列
1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。
往每个混合反应液中加入2微升FuPaReagent,总体系达到22微升。
2.充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)
3.将PCR管放入PCR仪,按以下程序运行。
温度
时间
50°C
10分钟
55°C
10分钟
60°C
20分钟
10°C
持续(最长至1小时)
将接头连接至扩增产物并纯化
配蚤并运行连燥反应
1.如果有可见的沉淀物在Switch溶液中,通过室温下炭荡或上下吹吸来溶解并重悬。
2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。
在加入之前可先混合Switch溶液和接头。
Examplebarcodeadaptermixforupto厶reactions
Component
Volume
IonP1Adapter
2pL
IonXpress,MBarcodeX*
2pL
Nuclease-freeWater
hpL
Total
8pL
X=barcodechosen
成分体积(uL)
SwitchSolution
4
稀释的barcode接头混合物
2
总体积
28
3.在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。
4•充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上
的液体上下吹打至少5次来混匀)
5•将PCR管放入PCR仪,按以下程序运行。
温度
时间
22°C
30分钟
72°C
10分钟
10cC
持续(最长至1小时)
暂停点-产物可以1[于-20°C保存。
纯化未扩增的文库
使用Agencourt®AMPure®XP试剂1.5x样本体积
重要事项!
-将AMPure©―XPreagent置于室温并充分振荡将磁殊混匀,使用时缓慢吸取•接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。
对每个样品,混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。
1.将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内,加入45微升(1・5x样本体积)的Agencourt®AMPure©XP试剂。
用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。
2.将混合液置于室温5分钟。
3.将1.5ml离心管置于DynaMag™-96SideMagnet(Cat.no.12331D)磁力架上,静置2分钟或者等溶液变清澈。
小心地吸走并弃掉上清,不要扰动磁珠。
4.向离心管中加入150uL新鲜配制的70%乙醇,在磁力上来回移动1.5ml离心管来洗涤磁珠,然后小心地弃去上清,不要扰动磁珠。
5.重复第4步,进行第二次洗涤。
6.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。
将1.5ml离心管放置于磁力架上,室温空气干燥5分钟,注意不要过度干燥。
7.将1.5ml离心管从磁力架上拿开.在毎管中加入50uLLowTE充分浸润磁珠。
充分振荡混匀,轻度离心将液体收集到管底。
(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)
8.将1.5ml离心管置于磁力架上2分钟。
上清液中含有文库。
文库扩增:
1•将1.5mlEP管从Z兹力架上取下,加50I
PIatinum®PCRSuperMixHighFidelity和2uI
ofLibraryAmpIificationPrimerMix。
Platinum®PCRSuperMixHighFidelity和LibraryAmpIificationPrimerMix需要事先混合好。
充分漩涡震荡E简单离心,或者用枪上下吹吸5次。
2.将1.5mlEP管放在型力架上至少2分钟,将上清约50uI转移到一个干净的200uLPCR内。
3.运行一下PCR程序
Stage
Temperature
Time
Hold
98°C
2min
5cycles
98°C
15sec
64°C
1min
Hold
10°C
Hold
纯化扩增后的文库
第一轮纯化
1.力u入25nI(0.5X的样品体积)Agencourt®AMPure®XPReagent到每个样品管中,用移液枪吹吸5次。
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在離力架上至少5分钟,直至溶液变澄清。
4.小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。
第二轮纯化
1.在第一轮纯化取到的上清中加入60uIAgencourt®AMPure®XPReagent,用枪头反复吹吸5次
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在磁力架上至少3分钟,直至溶液变澄清,将上清吸除。
4.加入150uI新鲜配置的70%的酒精,缓慢璇转两圈,将上清吸除。
5.重复步骤4
6.确保酒精完全被移除,打开管盖,常温干燥5分钟。
7.将样品管从磁力架上取下,加入50nILowTE,充分漩涡震荡,简单离心,或将移液枪调至40uI吹吸5次。
8.将样品管放入離力架后,静置两分钟,将上清转移到新的1.5ml离心管。
Qubit定量
1•制备Qubit®dsDNAHSreagent稀释液:
1uIQubit®dsDNAHSreagent加199uIQubit®dsDNAHSBuffero
2•在10nL的ampIifiedIonAmpIiSeq™Iibrary中加入190[1L的dyereagent,混合充分后静置2分钟。
3.1pL样品中加入199nLdyereagent进行测样。
定量完成后,不同引物的相同样品的管合为一管(相同浓度)每管定到300PM,
混合后能达到100PMo
IonPGM200bp自动模本制备
在IonOneTouch2instrumentJi制备模板ISP
1.4.1IonOneTouch2仪器准备
1.4.1.1打开IonOneTouch2背面的电源开关:
按触摸屛上OPENLID,等待离心机盖打开;
1.4.1.2参照图1将RecoveryTubes(IonPGMMTemplate0T2Supplies200)放置于
IonOneTouch2离心收集器的转子中,随后将RecoveryRouters(IonPGM™
Template0T2Supplies200)放置于相应位置,手动盖上离心机盖:
Reorders1
Romer-
Tube
1.4.1.3参照图2顺序将IonOneTouch™2AmpIificationPIate(IonPGMMTemplate
0T2Supplies200)放置于加热模块中,将加热模块手柄压向自己身体方向,
盖上IonOneTouch™Lid,导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上,将AmplificationPlate的注射针垂直插入IonOneTouch™DLInjectorHub,直至接触到底部的RecoveryRouter,然后松开注射针
□s
1.4.1.4IonOneTouch™OiI和IonPGM0T2RecoverySoIution添加
1.4.1.4.1每次开始使用新的IonPGM™Template0T2200Kit,丢弃掉前一个试剂盒使用的IonOneTouch"Sipper和IonOneTouch1^Tubes,戴上新的乳胶手套,装上新的IonOneTouch™Sipper;IonOneTouch™OiI瓶(IonPGMMTemplate0T2Solutions200)上下颠倒10次,倒入任意一个新的IonOneTouch™Tube中,约1/2满,安装至标示有人的下方相应位置拧紧;IonPGM0T2RecoverySoIution(IonPGMwTemplate0T2Solutions200)倒入另一个新的IonOneTouch™Tube中,约1/3满,安装至标示有0的下方相应位置拧紧;
1.4.1.4.2同一个IonPGM™TempIate0T2200Kit的后续使用准备时,将IonOneTouch™OiI(IonPGMQTemplate0T2Solutions200)瓶上下颠倒10次,取下有IonOneTouch™0iI的IonOneTouch™Tube,剧烈混匀至产生微小的气泡(图3),加入IonOneTouch™Oil,约1/2满,安装至标示有(人的下方相应位置拧紧:
将IonPGM0T2RecoverySoIution(IonPGM"Template0T2Solutions200)倒入另一个的含有IonPGM0T2RecoverySolution的IonOneTouch™Tube中,约1/3满,安装至标示有的下方相应位置拧紧;
1.4.2IonOneTouch反应液相准备及上机
1.4.2.1按照如下表格顺序室温配置体系,试剂来自IonPGM™TempIate0T2Reagents
200
顺序
试剂
管盖颜色
体积(ul)
处理方式及状态
1
Nuclease-FreeWater
25
2
IonPGM™Template0T2200ReagentMix
紫色
500
提前室温放置,充分溶解至无沉淀,漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于4°C
3
IonPGM™Template0T2200PCRReagentB
蓝色
300
充分溶解至无沉淀,漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于室温
4
IonPGM™Template0T2200EnzymeMix
褐色
50
短暂离心后,冰上放置
5
測序用文库
25
将定莹好的文库稀释至
15ng/mI,取2ul稀释到
25ul
TotaI
900
1.4.2.2将上述体系涡旋農荡5s,稍离心;
1.4.2.3将IonPGM™
Template0T2200IonSphere™Particles最大速漩涡混匀
1.4.2.4将IonPGMOneTouch™
1minT上下吸打5次后,吸取100ul,加入6.4.2.1的液相体系中.上下吸打混匀,室温放置备用;
PlusReactionFiIter(IonPGMMTemplate0T2
Reactions200)置于15ml离心管上(图4),将6.4.2.3种配制好的液相
体系漩涡混匀5s,短暂离心2s:
用1000ul移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔(图4)注入reactionfiIter,注意移液头与样
品孔紧密接触插紧:
FiIterTip移液头(防止交叉污染),再缓慢加入500ulIonOneTouch™
ReactionOil;
1.4.2.6如图5,将加样孔置于左侧,顺时针倒转reactionfiIter,避免管内导管
接触反应液相;
图5
1.4.2.7如图6,将reactionfiIter插入IonOneTouch™相应位置,边缘凸起位置
朝向自己;
1.4.2.8在系统显示屏上选择RUN(图7):
iontorrent
Ofb
CleanRunOptions
OpenLid
j:
1.65$0.00PSIj35.1C
图7
1.4.2.9选择IonPGM™Template0T2200kit(图8)
PGM:
IonPGM™TemplateOT2200Kit
图8
1.4.2.10然后选择Expert,最后点击NEXT开始运行。
1.4.3运行结束及IonOneTouch™清洗
6.4.3.1模板制备程序运行结束,在显示屏上选择两次next键,进入离心程序,约
10min;
6.4.3.2将注射针拔出,放入一个空的50mL的管子(图9);
图9
1.4.3.3打开离心收集器盖,用淸洁纸巾将盖子上的液体擦拭干净,拿掉Recovery
Router,小心缓慢将RecoveryTubes取出放于板架上,模板ISP位于
RecoveryTubes底部外侧(图10)
RwveryTube
LocationoriSPpeiiee
图10
1.4.3.4拿4^ReactionFilter,将CleaningAdapter(IonPGM"Template0T2
Supplies200)凸出部分面向自己插入相应位置(图门)
图11
1.4.3.5选择next铁退出离心程序,回到主界面,在屏幕上选择Clear,
1.4.3.6根据提示选择next,直至程序运行,运行时间约10min
1.4.3.7清洗结束后取下AmplificationPlate和废液管一起扔进专门的垃圾桶,关闭电源
IonOneTouch™ES的操作及阳性模板富集
1.5.1沿远离沉淀一侧,自液面开始小心将两管RecoveryTubes中的上清液吸掉,各舸余约50uL;
1.5.2取一个新的1.5mL的Non-StickTube,将RecoveryTubes中剩余50uL液体吹打10次后吸入其中;
1.5.3在两管RecoveryTubes中各加入100uLWashSolution(IonOneTouch™200SolutionsKitv2),吹打混匀后,吸入6.4.2的1.5mLNon-StickTube中;
1.5・4在6.5.3的5mLNon-StickTubes中再加入1000uL200uLWashSolution,最大转速漩涡振荡10s混匀,15500g离心3min;
1.5.5沿远离沉淀一侧,自液面开始小心吸掉上清液,剩余100uL在管底,低速漩涡振荡10s混匀;
1.5.6配制好新鲜的1MNaOH(1MNaOH<长可在一周内使用);
取一个1・5mL普通离心管,按如下表格配制Melt-OffSolution(每次新鲜配制)
顺序
试剂
体积(ul)
1
Tweensolution(IonPGM™Template0T2
Solutions200)
280
2
1MNaOH
40
Total
320
1.5.7吸取130uLMyOne™BeadsWashSoIution到一个新的1・5mL的Non-StickTube中;将Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads最大转速漩涡震荡30s,取13.0uL到上述1・5mL的Non-StickTube,漩涡振荡混匀30s,短暂离心2s;
1.5.8将6.5.7的离心管置于DynaMag™-2magnetJi2min或至溶液澄淸,小心吸掉上淸,避免碰触沉淀;将离心管从DynaMag™-2magnet上取下,吸取130uLMyOne™BeadsWashSolution到离心管中,漩涡振荡悬浮Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads;
1.5.9取一个8-weIIstrip(IonPGM™Template0T2Supplies200),方头永远
自己的左面,从左到右依次编号为1到8(图12):
图12
1.5.10按如下表格在8-weIIstrip中加入相应试剂(IonPGM™TempIate0T2
Solutions200)
孔綸号
对应孔试剂
1(方头第一
个)
6.5.5中的100ul模板ISP(U)
2
6.5.8中130ulDynabeads®MyOne™StreptavidinC1Beads(B)
3
300uLIonOneTouch™WashSoIution(W)
4
300uLIonOneTouch™WashSoIution(W)
5
300uLIonOneTouch™WashSoIution(W)
6
空
7
吸取300uL6.5.6中新绊配制的Melt-Offsolution(M)
8
空
1.5.11将8-wellstrip放入IonOneTouch™ES前方白色模块中的凹槽中,方头
在左,紧亲在凹槽右侧;
1.5.12取一个新的Tip(IonPGMwTemplate0T2Supplies200)放入TipLoader
中,从支架上取下TipArm插入TipLoader中,用力向下按紧1s,松开,取下TipArm放回支架上(一定要放到位),新的Tip已装在TipArm下方(图13):
图13
1.5.13在TipArm下方的洞中放一个开口的0・2ml的PCR管,里面加入NeutraIizationSoIution10uI(IonPGM™Template0T2Solutions200);
1.5.14打开IonOneTouch™ES电源,按Start/Stop键,运行过程中显示屏上一直显示"run",IonOneTouch™ES自动开始阳性模板富集;
1.5.15富集过程结束是,IonOneTouch™ES会有蜂鸣提示,并且显示屏显示“End”,整个过程约40min:
1.5.16结束后,将用过的Tip取下,和8-welIstrip—起扔进专门的垃圾桶,关闭电源
1.5.17取出0.2mLPCR管扣上盖子,15500g离心3min;
1.5.18沿远离沉淀一侧,从液面开始小心吸掉上清,剩余10uL在管底;
1.5.19加入200uLIonOneTouch™WashSolution,上下吹打混匀10次,15500g离心3min,沿远离沉淀一侧,从液面开始小心吸掉上清,剩余10uL在管底;
1.5.20加入100uLIonOneTouch™WashSolution,上下吹打混匀10次,若不立即进行后续的测序,可置于4°C保存2-3天。
IonPGM200bp读长上机测序操作
PGM的清洗
1.2.1氣片清洗(如果PGM趨过48个小时未使用,请首先用氟片清洗):
1.2.1.1将VM氣片淸洗瓶用每次50ml18MQ去离子水漂洗3次,备用:
W1清洗瓶用每次50ml18MQ去离子水漂洗3次后.加满250ml18MQ去离子水,备用;
1.2.1.2将1L的容器用毎次100ml18MQ去离子水漂洗3次,装满1L18MQ去离子水,放入一片PGMCleaningTablet(IonPGM™SequencingSolutions200Kitv2),静置10min;
1.2.1.310min后,加入1ml1MNaOH,混匀(该溶液请在2-3小时之内使用);
1.2.1.4用0.22um滤器过滤250ml以上氟片溶液到W1氣片清洗瓶中;
1.2.1.5打开PGM电源,氨气输出气压调至30psi;
1.2.1.6PGM启动完毕后,点击进入Clean莱单,确保芯片座上有一块旧芯片;
1.2.1.7按屛幕提示,勾选Chloritecleaning,点击NEXT:
1.2.1.8通过后扶提示将W1氣片清洗瓶拧上W1位(保证有吸管):
1.2.1.9将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管,清空废液瓶的废液;
1.2.1.10去掉前端四种dNTPs尖底管,不要职下吸管,在吸管下放置废液缸;
1.2.1.11按next,进入清洗程序;
1.2.1.12第一轮清洗结束后,用18MQ去离子水涮洗W1位的吸管,将含250ml18MQ去离子水的W1清洗瓶拧上W1位,按next进入第二轮清洗程序;
1.2.1.13第二轮清洗结束,整个PGM清洗结束,可进入初始化步骤:
1.2.218MQ去离子水清洗(两次初始化之间小于24h):
1.2.2.1W1清洗瓶用毎次50ml18MQ去离子水漂洗3次后,加满250ml18MQ去离子
水,备用;
1.2.2.2打开PGM电源,欽气输出气压调至30psi;
1.2.2.3PGM启动完毕后,点击进入Clean菜单,确保芯片座上有一块旧芯片;
1.2.2.4按屏幕提示,勾选18-M0hmwatercleaning,点击NEXT:
1.2.2.5通过后按提示将W1清洗瓶拧上W1位(保
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