基于ndhF序列的植物遗传关系分析毕业论文.docx
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基于ndhF序列的植物遗传关系分析毕业论文
SHANDONGUNIVERSITY OF TECHNOLOGY
毕业论文
基于ndhF序列的植物遗传关系分析
学院:
生命科学学院
专业:
生物技术
中文摘要
随着分子生物学和生物信息学的快速发展,基于各种分子数据的分析已成为植物系统学研究的主要手段,其中以DNA序列的比较分析应用最为广泛。
植物拥有3套基因组,按进化速率由快到慢依次为核基因组(nDNA)、叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)(Wolfeetal.,1987)。
每套基因组不同区域的核苷酸进化速率不同,为各分类阶元的系统学研究提供了丰富的变异来源。
ndhF是叶绿体功能基因,该基因共含有21个编辑位点,且这21个位点均为部分编辑。
生物信息学分析与与其它物种比对结果表明,ndhFC290位编辑可能会影响该蛋白的正确折叠。
进一步使用单克隆酶切方法测定了不同胁迫处理对ndhFC290位编辑效率的影响。
论文基于ndhF序列对几种植物进行了遗传关系分析。
首先从GenBank数据库中筛选植物序列,所得序列利用软件进行相关分析,根据遗传距离与分子系统学分析对ndhF片段长度对比,研究并分析菊属、紫草属、狗尾草属植物的遗传关系。
关键字:
ndhF,分子系统学,遗传关系分析,GenBank数据库
Abstract
Withthedevelopmentofmolecularbiologyandbioinformaticsofrapiddevelopment,basedonavarietyofmoleculardataanalysishasbecomethemainmeansofplantsystematicsresearch,ofwhichDNAcomparativesequenceanalysisismostwidelyused.Theplanthas3setsofgenome,accordingtotheevolutionaryratefromfasttoslowinthenucleargenome,chloroplastgenome(nDNA)(cpDNA)andmitochondrialgenome(mtDNA)(Wolfeetal.,1987).Eachgenomewithindifferentregionsofnucleotideevolutionrate,foreachtaxonofthesystemscienceresearchprovidesarichsourceofvariation.
ndhFisafunctionofchloroplastgene,thegenecontains21editsites,andthese21lociarepartofediting.Bioinformaticsanalysisandotherspeciesthantheresultsshowthat,ndhFC290editorsmayinfluencetheproteiniscorrectlyfolded.FurtheruseofmonoclonalenzymedigestionmethodforthedeterminationofthedifferentstresstreatmentsonndhFC290editingefficiency
BasedonthendhFsequenceofseveralplantperformedageneticrelationshipanalysis.First,fromtheGenBankdatabasescreeningplantsequences,thesequenceusingthesoftwareaccordingtothecorrelationanalysis,geneticdistanceandmolecularphylogeneticanalysisofndhFfragmentlengthcomparison,researchandanalysisofgeneticrelationshipoforchids
Keywords:
ndhFgenetic,molecularsystematics,GenBankdatabase,relationshipanalysis
第一章引言
1.1课题背景和意义
菊科是菊糖完全代替了淀粉作为多聚糖贮存。
菊科所含有的倍半萜酯类具有强心、抗癌、驱虫、镇痛等作用。
禾本科是种子植物中最有经济价值的大科。
是人类粮食和牲畜饲料的主要来源,也是加工淀粉、制糖、酿酒、造纸、编织和建筑方面的重要原料。
紫草科有著名药用植物紫草、早春野花斑种草、附地菜等,并且有与紫草具有同样药效的软紫草、滇紫草等;有饲料植物聚合草;有观赏植物基与树(茶)、牛舌草;有油料植物破布木。
随着生物技术的发展,鉴别技术已从植物形态鉴别的器官水平,向以显微粉末为基础从维管束、薄壁细胞、石细胞等形态和结构来鉴别的细胞水平发展,并正向以DNA鉴别和多态性分析、化学成分鉴别等为特征的分子水平深入。
隐存种的发现、识别与形成机制是分类学研究的一个难点。
虽然同工酶、RFLP、RAPD、核基因以与叶绿体DNA片段等分子手段被相继用于研究苔藓植物的隐存种形成机制,但是目前已报道的相关种类不过是冰山一角。
近年,DNA条形码技术受到了各国科学家的高度重视,已应用于分类学、分子系统学、种群遗传学的研究。
1.2GenBank数据库和NCBI
GenBank是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。
每条纪录都有编码区(CDS)特征的注释,还包括氨基酸的翻译。
GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织,包括EMBL和DDBJ。
GenBank数据库中的序列信息量大,来源物种丰富、涵盖广泛,尽管尚有一定不足,但仍可用于筛选植物候选DNA条形码。
根据GenBank中150条叶绿体ndhF基因的序列,采用BLAST相似性分析,评价了这两个DNA片段作为植物DNA条形码的可行性。
NCBI(美国国立生物技术信息中心)理解自然无声但精妙的关于生命细胞的语言是现代分子生物学的要求。
通过只有四个字母来代表DNA化学亚基的字母表,出现了生命过程的语法,其最复杂形式就是人类。
阐明和使用这些字母来组成新的“单词和短语”是分子生物学领域的中心焦点。
数目巨大的分子数据和这些数据的隐秘而精细的模式使得计算机化的数据库和分析方法成为绝对的必须。
挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性,并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具,以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解。
它的使命包括四项任务:
1.建立关于分子生物学,生物化学,和遗传学知识的存储和分析的自动系统2. 实行关于用于分析生物学重要分子和复合物的结构和功能的基于计算机的信息处理的,先进方法的研究3.加速生物技术研究者和医药治疗人员对数据库和软件的使用。
NCBI通过下面的计划来实现它的四项目的:
NCBI有一个多学科的研究小组包括计算机科学家,分子生物学家,数学家,生物化学家,实验物理学家,和结构生物学家,集中于计算分子生物学的基本的和应用的研究。
这些研究者不仅仅在基础科学上做出重要贡献,而且往往成为应用研究活动产生新方法的源泉。
他们一起用数学和计算的方法研究在分子水平上的基本的生物医学问题。
这些问题包括基因的组织,序列的分析,和结构的预测。
目前研究计划的一些代表是:
检测和分析基因组织,重复序列形式,蛋白domain和结构单元,建立人类基因组的基因图谱,HIV感染的动力学数学模型,数据库搜索中的序列错误影响的分析,开发新的数据库搜索和多重序列对齐算法,建立非冗余序列数据库,序列相似性的统计显著性评估的数学模型和文本检索的矢量模型。
另外,NCBI研究者还坚持推动与NIH部其他研究所与许多科学院和政府的研究实验室的合作。
1.3菊属、紫草属、狗尾草植物
1.3.1菊属、紫草属、狗尾草属植物的概况
菊属是菊科(Asteraceae)的一属。
约100种,多可供观赏,主要原产旧大陆亚热带与温带地区。
栽培种的头状花序较野生种大得多。
该属多数植物叶芳香,互生。
头状花序上盘花和边花同时存在或缺边花。
如野黄菊全国均有分布,紫野菊分布在华东、华北与东北地区,毛华菊分布在华中,甘菊多分布于东北与华北,小红菊多分布于华北与东北,菊花脑产于。
菊花品种遍布全国各城镇与农村,尤以、、、、、、、、、、、、、、市小榄镇等为盛。
8世纪前后,作为观赏的菊花由我国传至日本,被推崇为日本国微的图样。
为多年生草植物。
喜凉爽、较耐寒,生长适温18-21℃,地下根茎耐旱,最忌积涝,喜地势高、土层深厚、富含腐殖质、疏松肥沃、排水良好的壤土。
在微酸性至微碱性土壤中皆能生长。
而以Ph6.2-6.7最好。
为短日照植物,在每天14.5小时的长日照下进行营养生长,每天12小时以上的黑暗与10℃的夜温适于花芽发育。
紫草属是紫草科的一属,约60种,分布于温带地区,我国有4种,产西南至西北、东北,其中紫草L.erythrorhizonSieb.etZucc.的根供染料用。
一年生或多年生草本或亚灌木;叶互生,全缘;花白色、黄色或青紫色,组成穗状花序或总状花序;萼通常分裂,裂片5,线形;花冠管状或高脚碟状,裂片5,覆瓦状排列,喉部有时有附属体或有毛;雄蕊5。
藏,花丝短,花药长圆形,药隔有时伸出成一短尖头;子房4裂,胚珠4颗;小坚果4,平滑或有小疣体。
狗尾草属是禾本科,约140种,分布温带和热带地区,我国约17种,分布甚广,其中最常见的有狗尾草S.viridis(L.)Beauv.,金色狗尾草S.glauca(L.)Beauv.和粽叶狗尾草S.palmifolia(Willd.)Stapf等,茎叶可作饲料;粟(小米)S.italica(L.)Beauv.为我国很早就栽培的一种粮食作物,有很多品种和品系。
一年生或多年生草本;圆锥花序顶生,圆柱状或疏展呈塔状,小穗无芒,有1-2小花,全部或部分小穗托以1至数枚刚毛,脱落于极短而呈杯状的小穗柄上,刚毛宿存,第一颖卵形或圆形,比小穗短1/4至1/2,第二颖约与小穗等长,第一小花雄性或中性,外稃与第二颖同质,第二小花两性,外稃革质,平滑或有皱纹。
种子发芽适宜温度为15~30℃。
种子出土适宜深度为2~5cm,土壤深层未发芽的种子可存活10年以上。
中国北方4~5月出苗,以后随浇水或降雨还会出现出苗高峰;6~9月为花果期。
一株可结数千至上万粒种子。
种子借风、灌溉浇水与收获物进行传播。
种子经越冬休眠后萌发。
适生性强,耐旱耐贫瘠,酸性或碱性土壤均可生长。
生于农田、路边、荒地。
狗尾草,一年生草本。
秆直立或基部膝曲,高10-100cm,基部径达3-7mm。
叶鞘松弛,边缘具较径的密绵毛状纤毛;叶舌极短,边缘有纤毛;叶片扁平,长三角状狭披针形或线状披针形,先端长渐尖,基部钝圆形,几成栽状或渐窄,长4-30cm,宽2-18mm,通常无毛或疏具疣毛,边缘粗糙。
圆锥花序紧密呈圆柱状或基部稍疏离,直方或稍弯垂,主轴被较长柔毛,长2-15cm,宽4-13mm(除刚毛外),刚毛长4-12mm,粗糙,直或稍扭曲,通常绿色或褐黄到紫红或紫色;小穗2-5个簇生于主轴上或更多的小穗着生在短小枝上,椭圆形,先端钝,长2-2.5mm,铅绿色;第1颖卵形,长约为小穗的1/3,具3脉,第2颖几与小穗等长,椭圆形,具5-7脉;第1外稃与小穗等长,具5-7脉,先端钝,其稃短小狭窄,第2外稃椭圆形,具细点状皱纹,边缘卷,狭窄;鳞被楔形,先端微凹;花柱基分离。
颖果灰白色。
花、果期5-10月。
叶鞘较松弛,无毛或具柔毛;叶舌具长1~2毫米的纤毛;叶片扁平,长5~30厘米,宽2~15毫米,顶端渐尖,基部略呈圆形或渐窄,通常无毛。
圆锥花序紧密呈圆柱形,长2~15厘米,微弯垂或直立,绿色、黄色或变紫色;小穗椭圆形,先端钝,长2~2.5毫米;第一颖卵形,具3脉,第二颖具5脉;第一外稃与小穗等长,具5~7脉,有一窄狭的稃。
谷粒长圆形,顶端钝,具细点状皱纹。
花果期夏秋间。
1.3.2菊属、紫草属、狗尾草属植物的观赏价值
菊花是我国名花之一,历时历代受到人们的喜爱。
我国栽培菊花的历史悠远,长久以来人们在赏菊时形成了一定的品评标准,一盆合格的独本菊应具备:
每盆一本,着花一朵,花大瓣重,色泽艳丽,叶色墨绿,叶片肥大不脱节,茎干粗直,节间短密均匀,无病虫害,高度约45cm,能充分体现本品种的特点。
狗尾草初生时是小小的细细的一到两片的嫩叶,远望去几乎不见。
然而只需要一场微雨,便足以让它蓬勃成燎原之势。
虽然根须浅浅地几乎只是浮在土上,然而若是拔得不彻底或是拔完了仍然扔在地里,那么依旧是不能置它于死地的,只需要一夜的露水,便足以让它生出新芽或者复活,其生命力之强,常让人惊叹不已。
待到稍长大一些,便拔节生出一根细长的穗来,结满了千百颗籽粒,毛茸茸的摇曳在风里,仿佛调皮的小狗在抖动着尾巴。
1.3.3菊属、紫草属、狗尾草属植物的药用价值与其有效成分
菊花除有较高的观赏价值外,还有很多实用价值。
可以食用、茶用、药用。
《御香缥缈录》中记载:
慈禧爱吃白菊花。
人以菊花为酒宴名贵配料。
人以菊叶做菜入汤。
据说,人用菊花包饺子,其滋味清香爽口,引人食欲。
现已生产的菊花食品有菊花晶、菊花糕、菊花酒等。
菊花为菊科多年生草本植物,是我国传统的常用中药材之一,主要以头状花序供药用。
据古籍记载,菊花味甘苦,性微寒;有散风清热、清肝明目和解毒消炎等作用。
对口干、火旺、目涩,或由风、寒、湿引起的肢体疼痛、麻木的疾病均有一定的疗效。
主治感冒风热,头痛病等。
对眩晕、头痛、耳鸣有防治作用。
菊花有野菊和家菊之分,其中家菊清肝明目,野菊祛毒散火,甘苦微寒,清热解毒,对眼睛劳损、头痛、高血压等均有一定效用。
《本草纲目》中对菊花茶的药效也有详细的记载:
性甘、微寒,具有散风热、平肝明目之功效。
《神农本草经》认为,白菊花茶能“主诸风头眩、肿痛、目欲脱、皮肤死肌、恶风湿痹,久服利气,轻身耐劳延年。
”
现代医学也研究证实,菊花具有降血压、消除癌细胞、扩冠状动脉和抑菌的作用,长期饮用能增加人体钙质、调节心肌功能、降低胆固醇,适合中老年人和预防流行性结膜炎时饮用。
对肝火旺、用眼过度导致的双眼干涩也有较好的疗效。
同时,菊花茶香气浓郁,提神醒脑,也具有一定的松弛神经、舒缓头痛的功效。
中医多用以主治目赤、咽喉肿疼、耳鸣、风热感冒、头疼、高血压、疮疗毒等病症。
若长期食用,还有“利血气、轻身、延年”的功效。
现代临床医学也证明,菊花可扩冠状动脉,增加血流量,降低血压,对冠心病,高血压,动脉硬化、血清胆固醇过高症都有很好的疗效。
药用成分:
有腺嘌呤、胆碱、水碱(stachydrine)、密蒙花甙(acacetin-7-rhamnoglucoside)、木犀草素-7-葡萄糖甙、大波斯菊甙(cosmosiin)、刺槐素-7-葡萄糖甙(acacetin-7-glucoside)、布枯叶素-7-葡萄糖甙(diosmetin-7-glucoside)以与花色素;还含有挥发油,油中主含菊花酮(chrysanthenone)、龙脑、龙脑乙酸酯等。
尚含花色素-3-丙二酰葡萄糖甙[cyanidin-3-O-(6-C-malonyl-β-Dglucopyranoside]。
紫草最先作为中药,但也能提炼制成西药。
作为中药的功能主治凉血,活血,解毒透疹。
用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。
清热凉血,用于麻疹,热病癍疹,湿疹,尿血,血淋,血痢,疮疡,丹毒,烧伤,热结便秘。
作为西药的功能抗病原微生物作用、抗炎作用、对心血管系统的作用、避孕作用、抗肿瘤作用与其它作用。
药材基源为紫草科植物紫草、新藏假紫草或滇紫草的根。
临床作用有治疗急慢性肝炎、治疗肺结核合并血小板减少性紫癜、治疗恶性葡萄胎并发子宫绒毛膜上皮癌、治疗婴儿皮炎、外阴湿疹、阴道炎与子宫颈炎、治疗青年扁平疣与银屑病、治疗玫瑰糠疹。
紫草还有美容功效,紫草具有显著的祛痘和消炎的效果,有很大的美容价值,被荀草园的永乐坊、美体小铺、瑞士magiccare魔法护理等众多化妆品品牌列为化妆品功能性成分之一紫草的美容机理:
紫草主要功能为凉血,活血化瘀,解毒透疹,因此能加速痘印和疤痕的新代,加上其良好的杀菌消炎作用。
主要成分为:
紫草根含色素成分、脂肪酸。
色素成分为萘醌衍生物,有紫草素(紫草醌,Shikonin)、乙酰紫草素(Acetylshikonin)、去氧紫草素(Deoxyshikonin)、异丁基紫草素(Isobutyshi-konin)、异戊酰紫草素(Isovalerylshikonin)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(β,β-Dimethyla-crylshikonin)、β-羟基-异戊酰紫草素(β-Hydroxyisovalerylshikonin)、紫草烷(Alkannan)、紫草红(Alkannin)、α-甲基-正-丁酰紫草素(α-Methyl-n-butyrylshikonin)、3,4-二甲基戊烯-3-酰基紫草醌(Teracrylshikonin). 假紫草根含β-羟基异戊酰紫草醌、3,4-二甲基戊烯-3-酰基紫草醌.脂肪酸主要为软脂酸、油酸与亚油酸等。
狗尾草主治:
除热,去湿,消肿。
治痈肿,疮癣,赤眼。
①《纲目》:
治疣目,贯发,穿之即干灭也。
凡赤眼拳毛倒睫者,翻转目险,以一、二茎蘸水戛去恶血。
②《纲目拾遗》:
治疔痈癣。
面上生癣,取草效茎揉软,不时搓之。
③《民间方药集》:
解热,治目疾。
又用治麻(疣)子。
④《陆川本草》:
去湿,消肿。
治黄水疮。
⑤《草药》:
治目疾流泪起雾。
主要成分:
种子含脂类达6.6%,脂类中的脂肪酸为:
棕榈酸(palmiticacid),硬脂酸(dtearicacid),油酸(oleicacid),亚油酸(linoleicacid)和亚麻酸(linolenicacid),与痕量的肉豆蔻酸(myristicacid),棕榈油酸(palmitoleicacid)和花生酸(arachidicacid)。
甾醇(sterol),甾醇糖甙(sterolglycoside),和单酸甘油酯(monoglyceride)。
1.4DNA序列分析在植物分子系统学研究中的应用和难题
1.4.1分子系统学
近些年来随着分子生物学的迅速发展分子系统学(MolecularSystematics)发展起来,它利用大量分子实验的数据,采用生物统计学方法来研究生基因间和物体间的进化关系,事用来阐明植物系统进化的一门新兴的学科。
上世纪60年代中期最早将分子系统学研究应用于植物系统发育,它主要用于近缘物种和居群水平的系统发育研究。
20世纪70年代基因银行的建立积累了大量的DNA序列信息,PCR技术的不断发展又使得在基因水平研究植物的遗传变异成为可能,从而极推动了分子系统学的发展,使得系统发育研究水平达到了一个相当高的地步。
分子系统学的研究主要是从所要分析类群的一些代表物种和合适的外类群,选择和使所要分析的目的生物大分子或组合确定,并设法从中获得相关数据,对得到的数据进行比对或其它的数学方面的处理,借用遗传学分析软件对处理后的数据进行分析,之后构建分子系统树,最后对构建的系统树做相应的数学统计分析以检验系统树的可靠性。
分子系统学主要的容包括分类学研究、系统发育重建和分子进化和种群的遗传结构分析等几个方面,经常采用研究方法这几种:
DNA序列分析、RAPD、RFLP、AFLP、ISSR和同工酶标记等,在这些的方法中,最主要、最常用的是DNA序列分析方法是种群的遗传结构分析。
近年来随着DNA测序技术自动化水平的不断的提高,由于这种方法具有快速、高效、准确等优点,已经成为植物分子系统学研究领域方面的基石,在进化研究和植物系统发育中应用的越来越广泛。
1.4.2DNA序列分析在植物分子系统学研究中的应用
近些年来,分析许多存在争议的系统学问题采用分子生物学手段,已经获得了很大的成功。
基因序列分析是其中比较常用的手段之一.报道中已经用来作序列分析的基因主要有ITS与rbcL等。
DNA序列分析技术能应用于植物系统发育和进化研究中,该方法研究主要是通过提取植物的基因组DNA,设计引物并且扩增出适合进行系统进化研究的基因片段,进行测序之后进行序列比对,建立取代模型然后构建系统进化树,用来分析物种间亲缘关系和演化变异。
随着DNA测序技术的自动化水平不断提高,DNA序列分析的方法由于其快速、高效、准确的优点已经在植物分子系统学研究领域成为基石。
1.4.3DNA序列在植物分子系统学研究中的发展
1.4.3.1由DNA单一序列分析向多序列分析发展
在早期的植物分子系统学研究多仅选用一种来源的(nDNA或cpDNA)甚至一个DNA片段作为数据来源。
如在蔷薇科中,2002年前的研究中均只选用了一种DNA片段或单一来源的片段,大多数被子植物的叶绿体基因组为母系遗传(Corriveau&Coleman,1988),而核基因为双亲遗传。
因此,仅选用其中一种来源的DNA序列无法全面揭示杂交和异源多倍化等系统进化问题。
此外,不同植物分类群间DNA片段的进化速率并不一致,且一段长度有限的序列有时无法提供足够的信息位点。
近年来,越来越多的研究选用多种DNA片段来进行植物分子系统重建。
1.4.3.2由常用DNA片段分析向低拷贝核基因分析发展
长期以来,基于DNA序列分析的植物系统学研究依赖于cpDNA和nrDNA的重复区,特别是转录间隔区(ITS)的应用最为频繁。
但这两类DNA片段有时无法提供足够的信息位点,且nrDNA因存在不完全协同进化(incompleteconcertedevolution),在一些植物类群中并不能预期地解决其系统关系问题。
因此,低拷贝核基因(Low2copynucleargene,LCNG)因其丰富的资源和较快的进速率被广泛的开发和应用。
1.4.4在植物分子系统学研究中常见的难题
1.4.4.1系统分析结果存在冲突
通常基于DNA序列所构建的系统树为基因树(genetree),它并不一定能反映真实的物种树(speciestree)。
基于不同DNA片段构建的基因树间可能会存在分歧,即某些个体或群体在不同的基因树上的位置并不一致。
主要有如下几种情况:
(1)基于同一核基因位点的系统树上,同一种的基因序列在系统树的位置冲突,即种序列并非单系;
(2)基于细胞质和核基因序列的系统结果矛盾;(3)基于不同核基因位点间的系统结果矛盾;(4)基于叶绿体不同区域间的系统结果矛盾。
发现基因树存在冲突时,应首先排除取样不足与DNA序列信息位点不足的影响。
其次,需考虑选用的DNA片段的进化速率和进行系统分析时选用的替代模式是否妥当。
在此基础上,应着重考虑基因位点的谱系重排、基因的复制和丢失,或植物进化过程中经历的杂交、多倍化和基因水平转移等历史。
谱系重排或谱系分选(incompletelineagesorting,deepcoalescence)是后代对祖先多态等位基因进行随机保留的结果,即后代不同物种携带了祖先的不同等位基因。
谱系重排在核基因家族的
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