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5发酵过程控制
第四章发酵工艺过程控制
第一节发酵的操作方式
一、分批培养(batchcultureorfermentation)又称分批发酵,常用的培养方法。
1.概念:
在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后,接入少量的微生物菌种进行培养,在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。
分批培养中微生物的生长图
迟滞期 对数生长期 稳定期 死亡期
2.特点:
(1)整个培养系统与外界没有其它物质交换(O2、CO2、消泡剂、酸碱除外)
(2)整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化,是一种非稳态的培养方法。
即:
在发酵罐中完成微生物生长的四个阶段:
lagphase,logphase,stationaryphase,declinephase或deathphase
3.分批培养的优缺点
优点:
操作简单,周期短,染菌机会少,生产过程和产品质量容易掌握。
缺点:
产率低。
二、连续培养(continuousculture)
1.概念:
微生物培养到对数生长期时,在发酵罐中不断添加新鲜的培养基,同时不断放出代谢物,使微生物细胞在近似恒定状态下生长的培养方式。
2.特点:
最大特点是:
微生物细胞的生长速率,产物的代谢均处于恒定状态,有效地延长对数期到稳定期的阶段,可达到稳定,高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的,
菌的浓度,产物浓度,限制性基质浓度均处于恒定状态。
3.连续培养的优缺点
优点:
控制稀释速率可以使发酵过程最优化。
发酵周期长,产量高。
缺点:
长期连续培养会引起菌种退化,降低产量。
染菌机会增加。
与分批培养比较:
优点:
①连续运行,生产周期短,提高了设备利用率和生产效率。
②便于自动化控制,产品质量稳定。
缺点:
①连续操作,设备复杂,易受杂菌污染。
②收率和产物浓度低,不利于提取。
③营养物质利用率低,增加了生产成本。
④需要复杂的检测,控制系统。
⑤易受菌种退化的影响。
应用:
废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。
因此,连续培养在工业生产上并不多见,只局限于酒精,单细胞蛋白,丙酮,丁醇等少数几个产品。
在生产实践中,完全封闭式的分批培养或者纯粹的连续培养较少见,更多见的是两者的折中形式:
补料分批培养。
三、补料分批培养(fed-batchculture)
介于分批培养和连续培养之间的操作方法。
1.概念:
根据菌体生长和初始培养基的特点,在分批培养的某些阶段适当补加培养基,使菌体或其代谢产物的生产时间延长。
(克服营养不足,体积有所变化(增大))。
2.补料分批培养的优缺点
优点:
与分批培养相比:
(1) 解除底物抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。
(2) 延长次级代谢产物的生产时间。
(3) 可避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成细胞大量生长,耗氧过多的状况。
(4) 达到高浓度细胞培养。
(5) 稀释有毒代谢产物。
与连续培养相比:
(1)降低了染菌,避免了遗传不稳定性(退化和变异)。
(因为操作时间有限)
(2)最终产物浓度较高,有利于产物的分离。
(3)使用范围广。
在生产次级代谢产物和细胞高浓度培养中普遍采用。
是发酵技术上的一个划时代的进步。
缺点:
(1)由于没有物料取出,产物的积累最终导致比生产速率的下降。
(2)由于物料的加入增加了染菌机会。
应用:
面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。
3.几个实例:
产物
补料物
酵母菌
麦芽汁、氮、磷、镁
谷氨酸
氨水或尿素
柠檬酸
铵盐、糖
苹果酸
葡萄糖
淀粉酶
葡萄糖
青霉素
葡萄糖、氨水、苯乙酸
第二节 温度变化及其控制
一、温度对发酵的影响
1.影响反应速率:
发酵过程中的反应速率实际上是酶反应速率。
酶反应有一个最适温度。
2.影响发酵方向
如利用金色链霉菌发酵生产四环素的同时能生产金霉素。
在低于30℃下,合成金霉素的能力较强,而在35℃时只产生四环素。
另外,还影响发酵液的粘度、溶氧和传递速率。
二、最适温度的选择
最适发酵温度是既适合菌体的生长又适合代谢产物合成的温度。
但最适生长温度与最适生产浓度往往是不一致的。
如谷氨酸产生菌的最适生长温度为30~34℃,产谷氨酸的温度为36~37℃。
因此在发酵前期的长菌阶段和种子培养阶段应满足菌体的生长最适温度。
在发酵的中后期要适当提高温度。
随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。
培养基:
稀薄时,温度可低些。
温度高,营养利用快,使菌过早自溶。
培养条件:
通气条件差,可适当降温,使菌呼吸速率降低,溶氧可提高些。
三、发酵过程引起温度变化的因素——发酵热
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射
四、温度的控制
一般不需加热,因释放了大量的发酵热,需要冷却的情况多。
用夹套或蛇形管,通冷却水。
南方夏季,冷却水温度高,用冷冻盐水降温(循环式),需建冷冻站。
(图)
第三节pH变化及其控制P266
一、pH变化的原因。
微生物本身具有一定的调节pH的能力。
所以pH变化有一定的规律性。
菌体生长阶段,相对于接种后的起始pH来说,有上升或下降的趋势。
生产阶段,pH趋于稳定,维持在最适产物形成pH范围。
菌体自溶阶段,培养液中氨基氮增加,pH上升。
1.基质代谢
(1)糖代谢 糖分解成小分子酸、醇,使pH下降。
糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一。
(2)氮代谢 氨基酸中的-NH2被利用,pH下降;尿素被分解成NH3,pH上升。
(3)生理酸碱性物质利用后,pH上升或下降。
2.产物形成
3.菌体自溶:
pH上升
二、pH对发酵的影响
1.影响酶的活性。
2.影响微生物细胞的结构。
(影响细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性。
影响营养物质的吸收和代谢产物的排泄,影响新陈代谢的进行)
3.影响微生物对基质的利用速率。
(影响培养基中某些组分的解离)
4.影响代谢方向。
如黑曲霉pH2~3时产柠檬酸,pH中,产草酸。
谷氨酸:
中性或微碱产谷氨酸/酸性产谷氨酰胺。
三、pH值的确定和控制
1. pH的确定
微生物发酵的最适pH范围一般在5~8之间,同一菌种,生长最适pH可能与产物合成最适pH不用。
最适pH是根据实验来确定的,即配制不同初始pH的培养基,摇瓶考察发酵情况。
生长的最适pH值与发酵的最适pH值可能不同:
举例:
Aspergillusniger在pH2~2.5范围时有利于合成柠檬酸,当在pH2.5~6.5范围内时以菌体生长为主,而在pH7.0时,则以合成草酸为主。
谷氨酸:
中性或微碱产谷氨酸/酸性产谷氨酰胺。
2. pH的控制
(1)首先从基础培养基的配方考虑。
a.调节培养基的原始pH。
若控制消后SO4pH在6.0,消前pH往往要调到6.5~6.8。
若达不到要求,则:
b.加入缓冲溶液(如磷酸盐)或加入维持pH的物质如CaCO3。
c.使盐类和碳源的配比平衡。
(2)通过加酸碱和中间补料来控制。
a.过去直接加酸(H2SO4)或碱(NaOH),现常用:
生理酸性物质:
(NH4)2SO4,NH4+被细胞利用后,SO42-引起pH下降。
生理碱性物质:
氨水。
既补充氨,氮,又调pH。
但氨水作用快,pH波动大,要采用少量多次流加的方法。
b.补料既调节了pH值,又补充了营养,还可减少阻遏作用。
如:
味精厂普遍采用流加尿素,有两个作用:
调节pH值
补充氮源
第四节溶解氧及其控制
一、溶解氧(dissolvedoxygen,DO)对发酵的影响
要考察每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度,使发酵过程保持在最适浓度。
如青霉素发酵的临界氧浓度为5%-10%之间,低于此值就会对青霉素合成造成损失。
溶氧要适量,大小与产物的生物合成途径有关。
如:
初级代谢的氨基酸发酵,需氧量的大小与氨基酸的合成途径有关。
①谷氨酸,谷氨酰胺,精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸,在菌体呼吸充足的条件下,产量最大。
若供氧不足,氨基酸合成就会受到强烈抑制。
(乙醛酸循环磷酸烯醇式丙酮酸产生的NADH量多)
②异亮氨酸,赖氨酸,苏氨酸,天冬氨酸等天冬氨酸系氨基酸,供氧充足可得最高产量,但供氧受限,产量受影响不明显。
(产生的NADH量不多)
③亮氨酸,缬氨酸,苯丙氨酸仅在供氧受限,细胞呼吸受抑制时,才能获得对大量的氨基酸。
若供氧充足,产物形成反而受抑制。
(不经TCA循环,NADH产量很少,过量供氧,反而抑制)
(1)最适氧浓度(optimaloxygenconcentration):
——菌体生长或产物合成最适浓度范围。
(2)临界氧浓度(criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration):
——满足微生物呼吸的最低氧浓度。
二、溶氧浓度的控制
溶氧浓度决定因素:
供氧和需氧两方面。
(一)供氧方面:
1.调节搅拌转速
2.调节通气速率
(二)需氧方面:
1.菌体浓度和菌龄(呼吸旺盛,耗氧大)
2.基质种类和浓度:
营养丰富,浓度高,菌体生长快,耗氧量大。
以菌浓影响最明显。
3.培养条件:
在最适条件下发酵,耗氧量大。
控制方法:
通过控制基质浓度。
大型发酵罐搅拌装置(搅拌装置,温度传感器,耐高温pH和溶氧(DO)传感器)
第五节泡沫的形成与控制
一、泡沫产生的原因
1.通风搅拌程度及菌体新陈代谢产生的CO2。
2.培养基性质:
蛋白质含量多(玉米浆,蛋白胨,黄豆粉,酵母粉),糊精含量多易发泡。
二、泡沫的危害
1. 降低生产能力(装料系数减少)
2. 造成大量逃液 引起原料浪费,产物流失,增加了染菌的机会。
3. 严重时,影响通气搅拌,妨碍另外菌体呼吸代谢,导致代谢异常或菌体自溶。
三、泡沫的控制P260
两种途径:
-调整培养基成分(如少加或缓加易起泡的原材料)
-改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)
-改变发酵工艺(采用分批投料)
上述方法的效果有一定限度。
1.机械消泡:
(物理方法,消除已形成的泡沫)
利用机械振动或压力变化使泡沫破裂。
罐内消泡:
靠罐内消泡浆打碎泡沫。
优点:
不需引进外界物质,避免染菌,不增加下游负担。
罐外消泡:
将泡沫引出罐外,靠喷嘴的加速作用或离心力消除泡沫。
2.消泡剂消泡
机理:
降低液膜的机械强度,降低液膜的表面粘度,从而达到破裂泡沫的目的。
(1)天然油脂类:
豆油、玉米油、棉子油、菜籽油(还可作为碳源),用量大,0.1%-0.2%。
(2)聚醚类:
又称泡敌,消泡能力为豆油的10~20倍,用量少,0.02%-0.03%。
第六节发酵染菌及其防治
一、染菌的检查、判断
(一)观察法
1.菌体浓度(OD值)异常(OD:
opticaldensity光密度,吸光度,是细菌个数,菌体大小和发酵液色泽深浅的综合反应,用分管光度计测定)P260
OD值是细菌生长繁殖的指标。
正常发酵OD值得增长有一定的规律性。
例如:
细菌生长的适应期(4~6h)OD值增长缓慢;进入对数生长期,OD值明显上升,达最大值。
染菌:
OD值↑
染噬菌体:
OD值↓
2.溶解氧(DO,dissolvedoxygen)异常:
不同的发酵阶段溶解氧水平不同。
3.pH值异常
4.泡沫过多
5.排气中CO2的异常
(二)镜检法:
用革兰氏染色法对样品进行涂片,染色,然后再显微镜下观察。
根据生产菌与杂菌的特征区别,判断是否染菌。
(三)平板划线培养法或斜面培养检查法:
染菌有异常菌落。
待检样品在平板上划线,培养后镜检。
若使待检样品先增殖,再划线培养,即使有少量杂菌,也能被检出。
可提高灵敏度。
(四)酚红肉汤培养法:
染菌由红变黄。
牛肉膏,葡萄糖,蛋白胨,酚红,将待检样品直接接入培养后,镜检。
常用于检查培养基和无菌空气是否带菌。
二、发酵染菌的原因:
原因很多,普遍原因是:
1.种子带菌
2.空气带菌
3.设备渗漏:
往往造成各别发酵罐连续染菌。
4.培养基灭菌不彻底:
部分发酵罐染菌(芽孢菌)。
5.技术管理不善(如操作,中间补料操作)
前两者往往造成大批量发酵罐染菌。
三、染菌情况分析
1.单罐染菌
罐本身而非系统问题。
如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效。
2.多罐染菌
系统问题,如空气过滤系统有问题,特别是总过滤器长期没有检查,可能受潮失效;移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底。
从发酵染菌的时间来分析:
1.种子培养期染菌:
种子带菌,培养基或设备灭菌不彻底,接种操作不当或设备因素。
处理:
不接,灭菌后弃之。
检查,彻底灭菌。
2.前期染菌:
原因大致同上,还有空气带菌。
处理:
若培养基C,N含量较多,重新灭菌后再接种。
若培养基C,N消耗较多,可放掉部分料液,补充新鲜培养基,灭菌再接种。
3.中后期染菌
空气过滤不彻底,中间补料染菌(补料的料液灭菌不彻底)或设备(补料管道、阀门等)渗漏,泡沫顶盖及操作问题。
一般不会是种子问题。
若轻微染菌,可加入适量的杀菌剂或正常的发酵液。
若产品的量达到一定值,可放罐。
若无提取价值,灭菌后排放。
四、噬菌体(phage)染菌及其防治P267~268
(一)phage的检查
1.单层琼脂法:
用半固体培养基(1%琼脂),可加入Mg2+和Mn2+提高灵敏度。
2.双层琼脂法:
底层2%琼脂,上层1%琼脂,观察有无噬菌斑。
3.平板交叉划线法:
先取无噬菌体感染的指示菌划线(2%琼脂),再取待检样品液与其交叉划线。
如有phage,在划线的交叉处出现透明点。
4.液体培养检查法:
液体培养后测OD值,若OD值下降,说明样品中有噬菌体。
(二)phage的防治P269
工艺角度
1.消灭环境中的phage
2.药物防治:
螯合剂(如柠檬酸,植酸)、表面活性剂(吐温60)。
作用原理:
阻止噬菌体在菌体上吸附,抑制噬菌体。
菌种选育
1.轮换菌种:
利用phage对寄主细胞转移性强的特点。
2.选育抗phage的菌株P269
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