南医生化实验报告2.docx

南医生化实验报告2.docx

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南医生化实验报告2

南方医科大学

生物化学实验报告

一、实验目的

1.学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理、各试剂的作用及具体操作步骤；

2.学习并掌握PCR基因扩增的原理及具体操作步骤；

3.学习并掌握紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理及方法；

4.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

二、实验原理

1.质粒DNA的提取——碱裂解法

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH高达12.6的碱性条件下，细菌的线性染色体DNA氢键断裂。

其中，双螺旋结构解开而变性；而质粒中超螺旋结构共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

当以pH4.8的高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，线状染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起形成沉淀；而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，溶于上清液。

2.PCR基因扩增

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。

是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。

这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。

具体步骤为：

（1）变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链；

（2）退火：

使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合；

（3）延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，按5’→3’方向复制出互补DNA。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍。

3.紫外光吸收法定量检测质粒DNA

核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm。

核酸分子对紫外光的吸收强度与溶液中核酸的浓度成正比，即光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。

故可通过测定在260nm和280nm的A值的比值（A260/A280），估计核酸的纯度。

4.酶切鉴定

限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，构成大网孔型凝胶。

不同的琼脂糖浓度对应不同孔径的凝胶，可用于分离、纯化相对分子量不同的DNA分子。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

不同DNA分子因其所带的电荷数、相对分子量大小和构象不同，在同一电场中的电泳速度也不同，从而从而分出不同的区带，达到分离的目的。

三、材料与方法：

1.实验材料

（1）质粒DNA的提取—碱裂解法

样品：

菌液

试剂：

LB培养基（液体、固体）、溶液P1（S1）、溶液P2（S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）、漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent）

仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅、Eppendorf管、吸附柱、1.5ml收集管、离心管

（2）PCR基因扩增

样品：

菌液

试剂：

2×PremixTaq、引物1-SO100（10mol/L）、引物2-SO101（10mol/L）、灭菌的去离子水

仪器：

加样枪、0.2mlPCR反应管、台式离心机、基因扩增仪

（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA

样品：

提取的质粒DNA溶液

试剂：

灭菌的去离子水

仪器：

紫外分光光度计、UVette比色皿、1.5mlEP管、加样枪

（4）酶切鉴定

样品：

菌液

试剂：

灭菌的去离子水、10×R+BSA酶切缓冲液、质粒DNA、HindIII（15U/ul）、EcoRI（12U/ul）

仪器：

0.2ml收集管、加样枪、台式离心机

（5）琼脂糖凝胶电泳

样品：

质粒DNA溶液、PCR产物、酶切产物

试剂：

6×loadingbuffer、电泳缓冲液、DNAMarker5000

仪器：

加样枪、凝胶成像分析系统、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪

2.实验流程

（1）质粒DNA的提取—碱裂解法

13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，保留备用。

（2）PCR基因扩增

取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入4.5μl灭菌去离子水；

加入12.5μl2×PremixTaq；

加入1.5μl引物1-SO100（10mol/L）；

菌液煮沸10min,冷冻，室温解冻后离心取上清；

将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心；

加入5μl菌液；

加入1.5μl引物2-SO101（10mol/L）；

将反应管放到基因扩增仪（PCR仪）上。

（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA

取2μl质粒DNA溶液，加入UVette比色皿中，并与98μl灭菌的去离子水充分混合，测量并记录数据；

打开紫外分光光度计，在UVette比色皿中加入98μl灭菌的去离子水，调零；

重复上一步骤2次，测量并记录数据。

（4）

取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入9.0μl去离子的无菌水；

酶切鉴定

加入2.0ml10×R+BSA酶切缓冲液；

加入7.0μl质粒DNA；

混合均匀后，37℃水浴1.5h。

加入1.0μlHindIII（15U/ul）

加入1.0μlEcoRI（12U/ul）

电泳板放入电泳槽；

胶床准备；

铺胶；

（5）琼脂糖凝胶电泳

凝胶准备；

上样：

每排样品孔预留第一个孔，加DNAMarker5000；

第一孔：

5μl质粒DNA+1μl6×loadingbuffer混匀后上样；

加电泳缓冲液；

第二孔：

5μl酶切产物+1μl6×loadingbuffer混匀后上样；

第三孔：

5μlPCR产物直接上样；

拍照。

电泳；

四、结果与讨论：

1.实验结果

（1）紫外光吸收法定量检测质粒DNA

根据本次实验数据记得下表：

测定次数

A260/A280

DNA浓度（μg/ml）

1

1.96

34.8

2

1.82

36.9

3

2.09

31.8

平均值

1.96

34.5

经查阅资料可知：

A260/A280即Ratio的数值有以下含义：

当Ratio=1.8，则表示DNA样品较纯,符合实验要求；

当Ratio＞1.9，则表示DNA样品有RNA污染；

当Ratio＜1.6，则表示DNA样品有蛋白质或其它杂质的污染。

而本人本次实验所测，Ratio=1.96＞1.9，所以本次提取的质粒DNA有RNA污染。

同时DNA平均浓度为34.5μg/ml，表示本提取的质粒DNA含量较低。

（2）琼脂糖凝胶电泳

本次实验琼脂糖凝胶电泳结果如下：

本次实验琼脂糖凝胶电泳预期结果如下：

经与预期实验结果对比：

实验中质粒DNA的区带与预期实验结果中质粒DNA的区带略有区别。

预期实验结果中质粒DNA有两个区带，表示其中一种片段长度在5000bp以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp之间；而本次实验显示，质粒DNA有三个区带，其中两种片段长度都在5000bp以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp之间。

实验中酶切产物的区带与预期实验结果中酶切产物的区带不一致。

预期实验结果中酶切产物有两个区带，分别为酶切长片段，长度在2000bp-3000bp之间；含目的DNA片段的酶切短片段，长度在250bp-500bp之间。

而本次实验显示，酶切产物仅一个区带，且长度大约为3000bp，与酶切长片段长度基本一致；但含目的DNA片段的酶切短片段区带缺失。

实验中PCR产物的区带与预期实验结果中PCR产物的区带相一致，仅一个区带，且PCR产物的片段长度在250bp-500bp之间。

2.结果分析

本次实验结果显示：

（1）本次提取的质粒DNA有RNA污染且质粒DNA的含量较低。

（2）质粒DNA有三个区带，其中两种片段长度都在5000bp以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp之间；酶切产物仅一个区带，且长度大约为3000bp，与酶切长片段长度基本一致；但含目的DNA片段的酶切短片段区带缺失；PCR产物仅一个区带，且PCR产物的片段长度在250bp-500bp之间。

为此，经查阅资料与和同学讨论得以下影响因素及注意事项：

a.加入250μl溶液S1时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，不能有结块，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；

b.加入250μl溶液S2时，时间勿太久，轻轻颠倒4-6次，动作要温柔，不可剧烈震荡，避免把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中；

c.加入350μl溶液S3时，复性时间不宜过长，也不可以剧烈震荡；

d.EP管与管盖相连的一侧最好朝向离心机的外侧，便于离心后吸取上清液，吸取上清液的时候注意不要碰到沉淀；

e.在用70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀时，应尽量将乙醇挥发干净，因为残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定的时候，乙醇会使限制性内切酶失活；

f.菌液离心后除去上清液时，上清液应尽可能去除干净。

为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部；

g.注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。

也不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔；

h.DNA区带不清晰，有可能是点样量少或过大，也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂等原因；

i.为了消除RNA的影响，可以在电泳前加入RNA酶（约每10μlDNA加1μlRNA酶），37℃水浴30min；

j.配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。

因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA片段的电泳。

3.讨论总结

（1）碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？

溶液I：

由50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris·Cl（pH8.0）、10mmol/LEDTA（pH8.0）和Rnase组成。

作用是用葡萄糖悬浮细胞，EDTA鳌合金属镁离子、钙离子使DNase失活，也为溶菌酶的反应提供较低的离子强度的环境；

溶液II：

由0.2mol/LNaOH和1%SDS组成。

作用是溶解细胞膜上的脂质和蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

还可以解聚细胞中的核蛋白。

SDS可以与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。

溶液III：

5mol/L乙酸钠、冰乙酸和水组成。

作用是使溶液的pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在。

Na+可以中和DNA，且钠盐可以与SDS-蛋白复合物作用，从而使变性蛋白-SDS和线性DNA沉淀。

（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？

a.若在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

所以应该提高DNA的浓度，尽量将其中的蛋白质除尽；

b.不同限制性核酸内切酶对NaCl浓度的要求不同。

据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可以先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；

c.DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍，可以改变DNA的构象，使其简单化。

有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异；

d.实验中要有适宜的温度，多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。