郑州大学电气工程学院生物医学工程生物信息学实验报告.docx

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郑州大学电气工程学院生物医学工程生物信息学实验报告

生物信息学

实验五、电子克隆技术

（PCR引物设计及分析）

一、实验目的：

1、了解电子克隆技术的概念

2、了解电子克隆技术的基本步骤

3、理解PCR引物设计的基本方法

2、实验内容：

1、使用Primerpremier5.0软件进行人瘦素（leptin）mRNA引物的设计。

2、使用oligo6.0对引物进行评价分析。

3、实验步骤：

（一）、引物搜索

1、打开Primerpremier5.0软件，调入人瘦素（leptin）基因序列：

依次点击“file”，“open”，“DNAsequence”；或者直接依次点击“file”，“new”，“DNAsequence”，弹出一对话框，然后将序列人瘦素（leptin）基因复制在空白框。

2、序列文件显示后，点击“Primer”；

3、进一步点击“search”按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。

搜索目的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingPrimers），杂交探针（HybridizationProbes）。

搜索类型（SearchType）可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。

另外还可改变选择区域（SearchRanges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParameters）等等。

使用者可根据自己的需要设定各项参数。

我们将ProductSize设置300－350，其他参数使用默认值。

然后点击“OK”，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再点击“OK”。

4、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物（Anti-sense），成对显示（Pairs）。

默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。

5、按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。

下面进行序列筛选：

点击其中一对引物，如第21#引物，在“PeimerPremier”主窗口，该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。

当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由“None”变成“Found”，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。

一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有“Found”，只有“None”。

值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。

6、对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：

3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：

Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，

所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

按照以上要求，最符合要求的引物为第4#引物。

（二）、引物分析

1、打开oligo软件

2、单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“Ctrl＋O”可弹出一对话框，然后选择序列人瘦素（leptin）基因。

3、点击“window”再点击“Tile”，出现窗口中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。

如果觉得太拥挤，可去掉一个指标。

∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低，Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。

Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。

选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。

4、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。

下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。

5、当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。

可以用“Analyse”菜单分析你的引物：

比如有无引物二聚体、发卡结构等等。

首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。

需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。

二聚体形成的能值越高，越不符合要求。

一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。

第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。

当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。

这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。

第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。

当我们结束以上三项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

4、思考题

1、提交使用Primerpremier5.0及oligo6.0软件进行人瘦素（leptin）mRNA引物的设计结果；

答：

设计结果如前面实验步骤中所示。

2、总结引物设计应注意的关键事项。

答：

引物设计有几条基本原则：

首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。

围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值（meltingtemperature），ΔG值（internalstability），引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin），错误引发位点（falseprimingsite），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

以使用Oligo软件分析设计引物为例，总结出以下的要点：

1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

2.引物3’端的序列要比5’端重要。

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

3.引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。

5.ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。

7.引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。

8.对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。

此外，通过本次实验我得出西夏心得：

①两个评价系统不一样，oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。

这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。

②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下

③3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。

软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。

④GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。

所以设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。

3、如何判断一个分离的基因是否完整?

答：

①直接从序列上评价:

5′端:

（1）有同源全长基因的比较,通过与其它生物已有的对应基因末端进行比较来判断,

（2）无同源基因的新基因,Ⅰ.判断编码框架是否完整,a.在开放阅读框架的第一个ATG上游有同框架的终止密码,b.无终止密码的则考虑有保守的Kozak序列[12],Ⅱ.判断是否自转录起始点,有资料表明,在5′帽结构后一般都有一段富含嘧啶的区域,另外如果cDNA5′序列与基因组序列中经S1酶切保护的部分相同,则可以确定得到的cDNA5′是全长的。

另外还要看看有无启动子序列，这对一个未知的基因很重要，可联网http:

//knowledge_

3′端:

（1）有同源全长基因的比较,

（2）编码框架的下游有终止密码,（3）有一个以上的polyA加尾信号,（4）无明显加尾信号的则也有polyA尾。

②用实验方法来证实:

（1）NorthernBlot证实大小一致,

（2）用引物延伸法确定5′和3′的长度。