园艺植物病理学实验实习指导.docx
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园艺植物病理学实验实习指导
园艺植物病理学
目录
实验实习规则须知1
实验部分
实验一植物病害症状观察
实验二、植物病原真菌的一般形态观察
实验三、鞭毛菌亚门和接合菌亚门真菌形态观察
实验四、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门真菌形态观察
实验五、培养基的配制和灭菌
实验六、植物病原真菌的分离和培养
实验七、果树病害的症状和病原观察
实验八、蔬菜病害的症状和病原观察
实验九、观赏植物病害的症状和病原观察
实习部分
实习一、植物病害标本的采集和制作
实习二、园艺植物病害的调查与损失估计
实习三、园艺植物病害的诊断
实验实习须知
实验室的操作是从事植物病理工作的基本训练,所有操作均需按一定程序进行,借以加深和巩固对教学内容的了解。
学习植物病理学研究的基本方法并能通过实验结果的观察,初步学习科学分析和推理的方法,以培养良好的工作习惯。
教学实习的目的是让学生将课本上学习到的理论知识应用到具体实践中,提高同学们解决实际生产问题的能力,特别是鉴定病害标本的能力。
教学实习将为开展科研和技术推广工作打下一定的理论基础。
因此,实验实习时应切实注意以下各点:
一、实验实习前,必须认真对实验实习指导内容进行认真预习,明确目的要求、方法和步骤,熟悉主要操作环节,做好准备工作。
二、准备好实验用具3H-4H绘图钢笔、橡皮、直尺或三角板、绘图纸、报告纸、记录本。
三、实习小组在实习前应仔细清点实习用具、材料,填写仪器使用卡片,如有不符或损坏,应及时报告指导教师。
四、严格遵守操作规程,服从教师指导,认真完成实验实习规定的操作和观察项目,培养严肃认真、一丝不苟的科学态度和工作作风。
五、在实验实习场所,必须保持安静;爱护仪器,珍惜标本,节约药物,实验实习用品、材料等用后要及时整理,放归原处,不得乱拿乱用或随意丢弃,如有损坏按规定处理。
六、注意安全,严防着火、触电和药物中毒。
七、认真记录实验实习结果,写好实验实习报告(用统一规定的实验实报告纸)或完成其他作业,按时交批,由指导人员进行考核、评定成绩。
作业力求简明扼要,清晰正确,反对单纯抄袭、临摹参考书。
如实验实习报告不符合要求,必须退回重做。
缺实验、实习时,应申请补做。
八、每次实验实习结束时,由指导人员检查后,方可离开现场。
实验部分
实验一、植物病害症状观察
一、目的要求本次实验目的在于了解植物病害的种类及多样性,认识病害对园艺植物生产的危害性,并掌握病征和病状的一般类型,以便在田间病害诊断中加以利用。
二、仪器和用品体视显微镜、幻灯机、投影仪及多媒体教学设备、放大镜、镊子、挑针、搪瓷盘等。
三、实验材料蔬菜幼苗猝倒病、立枯病、黄瓜霜霉病、黄瓜花叶病、黄瓜白粉病、黄瓜细菌性角斑病、白菜软腐病、茄子褐纹病、番茄晚疫病、番茄叶霉病、番茄病毒病、辣椒疫病、辣椒疮痂病、菜豆锈病、苹果树腐烂病、苹果根癌病、苹果树缺素病、梨锈病、葡萄霜霉病、桃细菌性穿孔病、桃缩叶病、枣疯病、杨树溃疡病、大豆菟丝子、花生根结线虫病、牵牛花白锈病、油菜菌核病等新鲜材料或干制标本。
以上材料为实物标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片、多媒体教学课件(包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料)等。
四、观察内容及方法
(一)、病状类型:
1、变色:
由于叶绿素发育受到破坏,而使叶片的颜色发生改变,这种变色可以是普遍的也可以是局部的,变色的细胞本身并不死亡。
(1)褪绿:
叶片普遍变为淡绿色或淡黄色。
观察苹果树缺铁病
(2)黄化:
叶片普遍变为黄色。
观察番茄病毒病(黄顶型)
(3)花叶:
叶片局部褪绿,使之呈黄绿色或黄白色相间的花叶状。
观察黄瓜花叶病
2、坏死:
植物细胞和组织的死亡引起坏死。
植物的根、茎、叶、花、果实都能发生坏死。
(1)斑点:
局部组织变色,然后坏死而形成斑点。
观察芹菜斑枯病
(2)枯死:
植物组织连片坏死而呈现黄白色,褐色的或黑色,形成叶斑,叶枯、环斑、条斑或轮纹斑。
(3)穿孔:
叶片的局部组织坏死后脱落。
观察桃细菌性穿孔病
(4)疮痂:
植物体表先呈现皮包状隆起,然后表皮细胞破裂。
观察辣椒疮痂病。
(5)溃疡:
树木枝干的局部组织腐烂。
观察杨树溃疡病。
(6)猝倒或立枯:
幼苗的茎基部或根部组织坏死而使幼苗枯死,死苗倒下者为猝倒,死苗直立者为立枯。
茄子、辣椒幼苗猝倒病、立枯病
3、腐烂:
多汁而幼嫩的植物组织受害后植物细胞和组织易发生腐烂。
根据组织分解的程度不同,有干腐、湿腐和软腐之分,比较坚硬的植物组织发生腐烂称为干腐,柔软而多汁的植物的组织发生腐烂称为湿腐,寄主组织细胞间中胶层的破坏称为软腐。
观察苹果树腐烂病、苹果树干腐病、白菜软腐病。
4、萎蔫:
指植物根部或茎部的维管束组织受到侵染而发生的枯萎现象,萎蔫可以是局部的也可以是全株性的。
典型的萎蔫病害无外表病征,植物皮层组织完好,但内部维管束组织受到破坏。
观察茄子黄萎病、黄瓜枯萎病
5、畸型:
植株生长反常,促使植物的各个器官发生变态。
(1)矮化:
植株生长较正常的矮小。
(2)徒长:
植株生长较正常的植株生长高大。
(3)丛生:
枝干的节间停止伸长而使叶片呈丛生状。
(4)卷叶、蕨叶和缩叶:
叶片的卷曲和皱缩。
(5)发根:
根系过度分枝而成丛生状。
(6)瘿瘤:
部分组织细胞过度生长而形成的变态。
(7)剑叶:
叶片发育受到控制,使宽大的叶片变为细小狭长状。
(8)菌瘿:
病部变成菌的集合体,如黑粉病。
(二)、病征类型:
1、粉状物:
病原真菌在植物受害部位形成黑色、白色、铁锈色的粉状物。
观察黄瓜白粉病、菜豆锈病、慈菇黑粉病
2、霉状物:
病原真菌在植物受害部位形成白色、褐色、黑色的霉层。
观察葡萄霜霉病
3、小黑点:
病原真菌在植物受害部位形成的黑色小颗粒。
观察苹果树腐烂病
4、菌核:
病原真菌在植物受害部位形成大小不同的褐色或黑色颗粒。
观察油菜菌核病
5、白锈:
病原真菌在植物受害部位形成的白瓷状物。
观察牵牛花白锈病。
6、菌脓和菌痂:
病原细菌在植物受害部位形成的粘液和胶痂状物。
观察黄瓜细菌性角斑病的菌溢现象。
*注意:
以上病征只针对真菌和细菌,病毒、植原体、线虫病害和寄生性种子植物,以及非侵染性病害无病征表现。
五、作业与思考题
1.将上述病害标本的发病部位,病状类型和病征类型,填于下表:
植物病害症状观察表
病害名称
发病部位
病状类型
病征类型
2.植物病害的主要特征是什么?
3.症状在病害诊断上有什么作用?
4.植物病害对农业生产的危害性如何?
实验二、植物病原真菌的一般形态观察
一、目的要求通过本次实验熟悉真菌的营养体和繁殖体的基本形态,为以后真菌病害的病原物鉴定和病害诊断奠定初步基础,并初步掌握徒手切片、制片和绘制病原菌草图技术。
二、仪器与用品显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备,灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂(蒸馏水和乳酚油)、挑针、镊子、双面刀片、擦镜纸、无菌水等。
三、实验材料南瓜软腐病菌、茄科蔬菜猝倒病菌、立枯病菌、油莱菌核病菌、梨褐腐病菌、番茄晚疫病菌、黄瓜圆叶枯病菌、苹果白粉病菌、茄黄萎病菌、番茄早疫病菌、黄瓜根腐病菌、牵牛花白锈病菌等。
以上材料为实物标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片、多媒体教学课件(包括幻灯片、录像带、光盘等影像资料)等。
四、观察内容和方法
(一)、真菌的菌丝体及其变态和菌组织
1、无隔菌丝挑取培养皿中的南瓜软腐病菌或瓜果腐霉的少许菌丝体,用蒸馏水或乳酚油作浮载剂,制临时玻片镜检。
观察其菌丝形态特点。
提示:
浮载剂放得太多容易使盖玻片和观察物飘浮移动,不易镜检。
一般情况下,浮载剂只需加半滴即可。
2、有隔菌丝挑取培养皿中的镰刀菌的少许菌丝体,用蒸馏水或乳酚油作浮载剂,制临时玻片镜检。
观察其菌丝形态特点。
提示:
对一些无色透明的病菌,显微镜下观察时,注意调节光源,光线不宜过强。
挑取菌丝量尽量要少,并将其分散,以便观察。
3、菌丝变态
(1)吸器从幻灯片或照片观察吸器形态。
(2)假根取永久玻片,观察孢囊梗基部的假根——外表像根的根状菌丝。
(3)附着胞从幻灯片或照片观察炭疽病的附着胞形态。
4、菌组织体
(1)菌核观察油菜菌核病菌核的外形、颜色、大小,并镜检菌核切片,比较菌核外部组织和内部组织菌丝细胞的形状、大小及排列情况。
(2)菌索观察幻灯片上的根状菌索,是由菌组织形成的绳索状结构,外形与高等植物的根相似。
(3)子座切片观察苹果树腐烂病菌所形成的子座制片。
提示:
切片时要注意切得要薄,观察切片时往往看到的只是菌组织体整体结构的一部分,一定要注意从局部联想其整体轮廓。
(二)、真菌的繁殖体
1、无性孢子
(1)游动孢子囊和游动孢子。
挑取腐霉菌培养物,制作临时切片,镜检游动孢子囊和游动孢子。
(2)孢子囊和孢囊孢子挑取根霉菌培养物,制作临时切片,镜检孢子囊和孢囊孢子。
注意观察孢子囊的结构、囊轴、孢囊梗、假根及匍匐丝和孢囊孢子形态特征。
(3)分生孢子其色泽、形态变化较大,从无色至深色,单胞到多胞,并具多种形态。
采用挑、刮或切片的方法,取黄瓜圆叶枯病菌、苹果白粉病菌、番茄早疫病菌的病害标本,制作临时切片,观察分生孢子形态。
注意观察其分生孢子的颜色、分隔及其形状。
(4)厚垣孢子挑取镰孢霉菌的培养物制片、镜检。
菌丝中或孢子中个别细胞膨大、细胞壁加厚的孢子即厚垣孢子。
2、有性孢子
(1)休眠孢子囊挑取玉米褐斑病菌,镜检观察休眠孢子囊形态。
(2)卵孢子取谷子白发病病穗,制作临时切片,镜检卵孢子形态。
(3)接合孢子取永久玻片观察接合孢子形态。
(4)子囊孢子取山楂白粉病病叶,用解剖针将白粉上的小黑点(闭囊壳)仔细拨至载玻片上的水滴中,加盖片并轻轻压破闭囊壳,镜检闭囊壳,子囊、子囊孢子和附属丝的形态,特别注意子囊的数目和附属丝的特点。
(5)担孢子观察梨锈病冬孢子萌发形成的担子及担孢子的形态
五、作业及思考题
1.绘制有隔菌丝、无隔菌丝、营养体变态结构、各类无性孢子和有性孢子的形态图。
2.针对不同的病征类型在显微观察时应采用何种制片方法?
实验三、鞭毛菌亚门和接合菌亚门真菌形态观察
一、目的要求了解鞭毛菌亚门和接合菌菌亚门真菌的主要形态特征,掌握与植物病害有关的重要属的形态特征及所致病害的症状特点,为病害诊断打下初步基础。
二、仪器与用品显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备;蒸馏水、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、通草、酒精灯、无菌水等。
三、实验材料立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、致病疫霉菌、霜霉菌菌、牵牛花白锈病菌、根霉菌等。
以上病害有标本、新鲜材料、挂图、多媒体教学课件。
四、观察内容和方法
1.腐霉属观察瓜果的腐烂病病果上的白色菌丝体,将生长旺盛的小块菌丝体移至清水中培养24~48h,菌丝顶端即形成大量游动孢子囊,用针挑取在清水中培养过的菌丝,观察腐霉菌的游动孢子囊。
游动孢子囊丝状、姜瓣状或球状等,顶生或间生,无特殊分化的孢囊梗。
孢子囊不脱落,萌发时在其顶端产生一管状物,原生质经管状物排出而形成泡囊。
游动孢子产生在泡囊内。
2.疫霉属取马铃薯或番茄晚疫病标本制片观察。
孢囊梗2--3支成丛,自气孔伸出,假轴状分枝,小梗基部膨大,多次产生孢子囊,使孢子囊梗上部呈节状;孢子囊近球状、卵形或梨形等,具乳突。
3.单轴霉属观察葡萄霜霉病标本,注意为害部位及症状特点,挑取葡萄霉病病叶病斑上的霉层制片镜检孢子囊梗的形态,注意分枝特点及分枝末端的特征。
4.霜霉属观察十字花科霜霉病和大豆霜霉病标本,注意为害部位的症状和特点,然后挑取少许霉层制片镜检孢囊梗和孢子囊,注意孢子囊的梗分枝特点。
5.假霜霉属观察黄瓜霜霉病标本,注意为害部位和病状特点,挑取霉层制片或取制备片镜检孢囊梗和孢子囊,注意孢囊梗的分枝特点,与霜霉属形态有何异同。
6.白锈菌属镜检牵牛花白锈病菌组织切片,或取以上病叶徒手切片制成临时玻片镜检。
孢囊梗平行排列在寄主表皮下,短棍棒形,孢子囊串生。
白锈菌为害症状是在寄主表面产生乳白色或粉状的疱斑,这是病菌在寄主表皮下形成的孢子囊堆,白色粉状物是成熟的孢子囊。
7、接合菌亚门根霉属用挑针仔细地从培养的匐枝根霉菌中挑取少许连有培养基的培养物,制成临时玻片,在低倍镜下观察孢囊孢子、孢囊梗及囊轴、假根、匍枝状的菌丝。
五、作业及思考题
1.绘黄瓜霜霉病菌、番茄晚疫病菌孢囊梗、孢子囊、卵孢子图。
2.绘匍枝根霉菌孢子囊、孢囊梗、孢囊孢子、假根、匍匐菌丝形态图。
3.鞭毛菌亚门真菌的共同特征和分类依据是什么?
4.接合菌亚门真菌的主要特点是什么?
与鞭毛菌亚门有何区别?
实验四、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门真菌形态观察
一、目的要求通过本次实验了解子囊菌、担子菌、半知菌亚门真菌的主要形态特征,掌握与植物病害有关的重要属的形态特征,为病害诊断及病原鉴定打下良好的基础。
二、仪器与用品显微镜、计算机及多媒体教学设备;载玻片浮载剂(蒸馏水)、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、通草、酒精灯、无菌水等。
三、实验材料桃缩叶病、瓜类白粉病、小麦白粉病、凤仙花白粉病、丁香白粉病、苹果白粉病、葡萄白粉病、茄苗立枯病、茄褐纹病、苹果炭疽病、小麦白粉病、菜豆锈病、油菜菌核病、苹果腐烂病、番茄灰霉病、番茄叶霉病等。
以上病害有标本或新鲜材料、挂图,多媒体教学课件。
四、观察内容和方法
(一)子囊菌亚门
(1)外囊菌属挑取桃缩叶病病部表面灰白色霉层,观察子囊及子囊孢子的形态特征
(2)白粉属挑取瓜类白粉病病部白色粉状物和小黑点制片,镜检闭囊壳的形态,注意附属丝的性状和长短,然后用解剖针轻压盖片,挤压闭囊壳使之慢慢破裂,注意观察其内子囊的数目及形态,能否看到子囊孢子。
(3)叉丝单囊壳属取苹果白粉病标本,挑取小黑点制片镜检闭囊壳和附属丝,注意附属丝刚直,顶端一次或数次整齐的叉状分枝,闭囊壳内产生一个子囊特点。
(4)黑腐皮壳属取苹果腐烂病带小黑点的小块病皮组织切片镜检子囊壳的形状,颜色,着生部位及子囊壳和子囊孢子的形态
(6)核盘菌属取油菜菌核病,观察菌核萌发形成的子囊盘,平行排列的棍棒状的子囊和单胞纺锤形的子囊孢子,子囊间是否有侧丝。
(二)担子菌亚门
(1)单胞锈菌属取菜豆锈病病叶标本,观察夏孢子堆和冬孢子堆的大小、颜色,是否穿破表皮?
用解剖针挑取病叶上的冬孢子制片镜检,注意锈菌的形态特征。
(2)胶锈菌属取梨锈病标本,观察性孢子、锈孢子形状、大小、颜色,用解剖刀切取病叶上的性孢子、锈孢子制片镜检,注意该属锈菌的形态特征。
特别注意在转主寄主柏树上的症状,哪种孢子发生在柏树上?
该菌是否有夏孢子阶段?
取梨胶锈菌冬孢子电镜照片,注意该属上述特点。
(三)半知菌亚门
(1)丝核菌属
菌核褐色或黑色,内外颜色一致,菌丝褐色多直角分枝,在分枝处有缢缩。
取茄苗立枯病标本观察症状特点,挑取培养皿中培养的立枯丝核菌制片,镜检菌丝颜色,分枝和分隔的特点。
(2)粉孢属取小麦白粉病标本观察症状特点,,镜检白粉病菌,注意观察分生孢子梗及分生孢子的形态特点,分生孢子梗是否分枝?
是长还是短?
分生孢子是否单胞?
是否链生?
孢子成熟的顺序如何?
(3)葡萄孢属挑取番茄被害部位的灰色霉状物制片镜检番注意分生孢子梗及分生孢子着生情况,菌落颜色和木霉有何不同?
(4)褐孢霉属取番茄叶霉病病叶,自叶背病斑处挑取褐色霉层制片,观察分生孢子梗分枝及分生孢子着生情况,
(5)链格孢属挑取大葱紫斑病叶病斑上霉层制片,镜检分生孢子梗和分生孢子的形态,注意有无颜色?
分生孢子是否有纵横隔膜?
孢子顶端是否有喙状细胞?
(6)拟茎点菌属切取茄褐纹病叶片制片镜检分生孢子器及器孢子形态,能否见到钩形和卵圆形两种器孢子?
能否见到孢子器周围的子座组织。
(7)壳囊孢属用刀切取带小黑点的病皮制片,镜检分生孢子器及器孢子的形态,注意分生孢子器着生在瘤状子座组织中,分生孢子器腔不规则地分为数室,分生孢子梗极细,不分枝,分生孢子香蕉形或腊肠形等特点。
五、作业与思考题
1.绘番茄叶霉病菌形态图。
2.绘菜豆锈病菌冬孢子形态图。
3.绘苹果树腐烂病病菌形态图。
4.为什么说半知菌亚门和子囊菌亚门关系极为密切?
试就营养体,繁殖体形态以及为害植物的症状特点等方面加以分析。
5.植物白粉病发生的条件与霜霉病有什么不同?
为什么
6.白粉病为害植物的特点如何?
分类的主要根据是什么?
实验五、培养基的配制和灭菌
一、实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要,培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验,因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作,通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二、内容、材料和方法
(一)培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类,从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类,培养基的种类不同,配制方法也有差异,限于时间,本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)
这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA),主要用于植物病原真菌的分离和培养,有时也用于植物病原细菌。
成分:
马铃薯:
200克蔗糖:
10克琼脂:
20克加水至1000毫升
方法:
将马铃薯洗净去皮切块,加水煮沸半小时,用双层纱布滤去薯块,补足水量,加入琼脂,加热熔化,再加糖,待完全化后,乘热用双层纱布过滤分装,塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性,培养真菌无需调节pH,培养细菌则调节pH至中性,此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用,故不必调节pH。
5人分作一组,1、2组各作此培养基500毫升,其中200毫升分装试管,每管约10毫升,灭菌后摆成斜面;其余300毫升,分装在3个250—300毫升的三角瓶中,每瓶装100毫升左右,灭菌后妥善保存,留待下次实验使用。
2、牛肉膏蛋白胨培养基(NA)这种培养基主要用于细菌的分离和培养
成分:
牛肉浸膏:
3克蛋白胨:
10克蔗糖:
10克
酵母浸膏:
1克琼脂:
20克加水至1000毫升
方法:
先将琼脂加热熔化于大部水中,再将其它各成分用少量水化开加入,调节pH至7,趁热用双层纱布过滤,分装,塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠,不易称重,称重时用小烧杯盛装,以玻璃棒沾取,故要先称好杯和棒的重量后,再开始沾取浸膏称重,称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
调节培养基pH至中性的方法如下:
配成1N的HCl和NaOH,并另分别稀释配成1/20N的HCl和NaOH。
取培养基2毫升,加蒸馏水7.5毫升,加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴,这时如培养基的测样呈黄色则用有刻度吸管加入1/20N的NaOH若呈蓝色则加入1/2ON的HCl,使培养基最后呈草绿色即调节到中性,此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培养基中所需要加入lN的NaOH或HCl的毫升数(注意这次是作500毫升培养基),加蒸馏水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。
调节pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。
也可以用多孔白色瓷板,在孔中加少量培养基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴,根据颜色反应,在所配的培养液中加入少量lN的NaOH或HCl,然后再取样测定,如此反复多次,达到所需求的反应为止。
5人分为一组,3、4两组各作此培养基500毫升,其中200毫升分装试管,每管约100毫升,灭菌后摆成斜面,其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中,每瓶装100毫升左右,灭菌后妥善存放,留待下次实验使用。
此外,1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。
(二)、培养基的灭菌为了得到某种病原物的纯培养,配好的培养基必须经过灭菌才能使用,灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的所有微生物,灭菌与消毒的概念不同,消毒则是指消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌),而不是消灭所有的微生物。
灭菌的方法很多,植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法,一般培养皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。
而培养基和实验用的土壤,则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌,具体灭菌方法和步骤如下:
1、干热灭菌法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后,用旧报纸包好,或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒),包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端,以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中,彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门,打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时,闭上排气孔,继续加热至一定温度后,用定温固定温度,灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿,避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
2、高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌,它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度,达到灭菌的目的,其操作步骤如下:
(1)关好排水阀门放入清水至标度为止,注意水量一定要加足,否则容易造成事故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中,并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中,关上器盖,旋紧螺旋时,先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧),然后再旋紧相对的两个螺旋,以达到平衡旋紧,否则易造成漏气,达不到彻底灭菌的目的。
(3)通电加温,同时打开排气活门,排尽锅内的空气,即活门冲出的全部是蒸气时则表示彻底,此时可关闭排气活门,如果过早关闭活门,排气不彻底,也达不到彻底灭菌的目的。
通常当压力表指针升至5磅时,打开排气活门放气,降至零点,再关闭活门。
(4)压力表的指针上升时,锅内温度也逐渐升高,当压力表指针升至15磅时,蒸气温度相当于120℃—121℃(等于一个大气压),此时开始计算灭菌时间,控制热源,使处于15磅压力保持30分钟,即能达到完全灭菌的目的,然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门,使锅内蒸气缓慢排除,然后逐渐开大活门,气压徐徐下降,注意勿使排气过快,否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞,但排气太慢又使培养基在锅内,受高温处理时间过长,这样对培养基也是不利的。
一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时,打开锅盖取出培养基,如需制备固体斜面培养基时,则应趁热将试管斜放在桌上,上面盖上报纸以免落灰尘,冷却后便可收起。
(7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
(8)抽取上述灭菌的培养基,放入25℃温箱中,48小时后不见杂菌生出,便证明培养基已达到灭菌目的,可以使用。
此外,有些培养基在经高压灭菌后,其营养成分容易分解而失去使用价值,此时可采用间歇蒸气灭菌法,即将培养基放入高压灭菌器内,加热至100℃,保持1小时,每天灭菌一次,连续进行三次,即可达到灭菌的目的,又不至使营养物质分解。
三、作业与思考题
1.培养基有哪几种类别?
各有什么特点和用途?
2.怎样检查培养基灭菌是否彻底?
3.干热灭菌和高压蒸汽法适用范围如何?
电热烘箱和高压锅如何操作?
各有哪些使用注意事项?
实验六、植物病原真菌的分离和培养
一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中,常常需要病原菌的纯培养物。
然而,在自然情况下,病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的,从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来,叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法
(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响,因
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