微生物遗传与分子生物学习题.docx

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第一章绪论

1.Griffith和Avery等人是如何证实转化因子的实质是DNA的？

（1）细菌的转化实验：

肺炎链球菌是一种致病菌，野生型有毒力，称为S型，其突变型无毒力，称为R型。

Griffith在观察有毒和无毒菌株在活体内的相互作用时发现：

当把加热杀死的S型菌和活的R型菌混合培养时，能从中分离出活的S型菌，并能继续传代。

说明在加热杀死的S型菌中存在某种能使活的R型菌转变成S型菌的遗传因子，他们把这种现象称为转化。

其后，Avery等人在1944年对转化因子的本质进行了鉴定。

他们从S型菌的细胞物质中抽提并纯化出转化因子，将它用多种蛋白水解酶处理后并不影响转化效果，如果用脱氧核糖核酸酶去处理则转化现象即刻消失，从而直接证明了转化因子是DNA。

（2）噬菌体感染实验

Hershey和Chase于1952年以T2噬菌体为材料进行了噬菌体感染实验。

T2噬菌体是大肠杆菌噬菌体，它由蛋白质（60%）外壳和DNA（40%）核心组成。

蛋白质中含有硫而不含有磷，DNA中含有磷而不含有硫，所以用同位素32P和35S标记T2噬菌体进行感染实验，就可以分别测定DNA和蛋白质的功能，结果证明遗传物质的实质是ＤＮＡ。

2.微生物基因突变一般分为几种类型？

突变有什么生物学意义？

基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗传物质改变等方面进行分类。

a.按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型:

1）.形态突变型2）.生化突变型3）.致死突变型:

b.按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为：

1）. 错义突变2）. 同义突变3）. 无义突变

c.根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。

d.根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。

突变的生物学意义：

基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。

但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。

所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。

环境不断改变，生物通过不断突变而适应,也就使其被保存下来。

最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。

无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。

第二章第一节链霉菌遗传特性及主要研究技术手段

1、应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？

能否用在你们今后的实验中？

（基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。

原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。

）

一、链霉菌基因组编辑技术有：

1、I-SecIendonuclease介导的同源重组系统：

敲除质粒上含有一串联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点（sceS）。

将该质粒导入链霉菌细胞，并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。

如果发生同源单交换，该质粒将被完整导入基因组靶位点。

通过诱导表达SecI，SecI在sceS位点切断基因组DNA，菌体不能够存活。

如果发生同源双交换，sceS被删除，即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂，菌体仍然存活，并表现出抗性敏感。

2、CRISPR-Cas9介导的同源重组系统：

首先优化cas9的密码子，将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上。

敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后，sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列，敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。

将该质粒导入链霉菌，CRISPR/Cas9系统将靶位点切断，同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换，将断裂的靶基因区删除，基因组重新连接。

（CRISPR/Cas9系统先切断靶序列后直接发生双交换，最后断裂的靶基因直接被敲除）

3、位点特异性整合酶介导的基因组编辑：

（cre/lox系统）

利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游，再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌，在Cre蛋白的作用下，两个loxP位点发生位点特异性重组，完成目的基因片段的敲除。

而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制，随着传代而丢失。

二、大片段DNA克隆的技术：

1、依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆（TAR）

基于FBT1attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术：

通过接合转移将质粒pSV:

:

attB6Up导入链霉菌，卡那霉素筛选获得pSV:

:

attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。

再将pKC1139:

:

attP6Dn导入S-attB6，在40度培养，pKC1139:

:

attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。

通过接合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中，利用整合酶将目的基因簇环出，并克隆到载体pKC1139上。

2、CRISPR/Cas9系统介导的DNA大片段克隆：

RNA指导的Cas9在特定位点将染色体切开，在两端分别与目标片段有30bp重叠序列的质粒被连接到目标片段上。

重组质粒被电转到宿主细胞内。

在今后的实验中可能会用到：

我们实验室是分子生物学实验室，这些技术方法对于我今后的研究是有助益的。

我们平时多采用基本的遗传操作，构建敲除质粒载体，然后导入受体菌株进行同源重组进行单交换，利用抗生素进行筛选，随后还需要进行双交换。

我们可以考虑使用基因编辑技术来进行遗传操做。

比如应用CRISPR-Cas9介导的同源重组基因编辑技术来使之直接发生双交换而直接敲除靶标基因，这样操作起来并不繁琐，也省去了些过程，并且对是否发生双交换也比较好判断。

1、依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆（TAR）

2、I-SecIendonuclease介导的同源重组系统

敲除质粒上含有一串联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点（sceS）。

将该质粒导入链霉菌细胞，并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。

如果发生同源单交换，该质粒将被完整导入基因组靶位点。

通过诱导表达SecI，SecI在18个碱基的位点（sceS）切断基因组DNA，菌体不能够存活；如果发生同源双交换，sceS被删除，即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂，菌体仍然存活，并表现出抗性敏感。

3、位点特异性整合酶介导的基因组编辑

（1）利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游，再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌，在Cre蛋白的作用下，两个loxP位点发生位点特异性重组，完成目的基因片段的敲除。

而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制，随着传代而丢失。

（2）基于FBT1attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术

通过结合转移将质粒pSV:

:

attB6Up导入链霉菌，卡那霉素筛选获得pSV:

:

attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。

再将pKC1139:

:

attP6Dn导入S-attB6，在40度培养，pKC1139:

:

attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。

通过结合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中，利用整合酶将目的基因簇环出，并克隆到载体pKC1139上。

4、CRISPR-Cas9介导的同源重组系统

首先优化cas9的密码子，将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上，敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后，sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列，敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。

将该质粒导入链霉菌，CRISPR/Cas9系统将靶位点切断，同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换，将断裂的靶基因区删除，基因阻重新连接。

（1）CRISPR/Cas9系统用于系统的代谢工程研究，可以构建随机基因敲除突变体库，进行精确的基因组编辑，以及进行精确的基因或基因簇置换。

（2）CRISPR/Cas9系统可以通过同源重组进行基因的定点突变。

（3）CRISPR/Cas9系统可用于基因调控，即Cas9与激活子或抑制子融合，从而调控被gRNA靶向的基因的表达水平。

（4）CRISPR/Cas9系统可用于对DNA大片段进行克隆。

第二章第二节链霉菌发育分化与次级代谢产物的生物合成

作为丝状细菌的链霉菌经历一个怎样的分化过程？

次级代谢产物在什么阶段产生？

链霉菌的形态分化和生理分化（次级代谢）对其自身有何意义？

作为丝状细菌链霉菌的分化过程为：

1，孢子萌发形成基质菌丝；

2，基质菌丝延伸、分枝；（光秃表型）

3，向空气中生长形成气生菌丝；

4，气生菌丝产生螺旋和分隔；（白表型）

5，分隔加深形成孢子链；

6，孢子链变灰，成熟；（灰表型）

7，释放游离孢子。

链霉菌的发育分化过程中有部分的基质菌丝和未分化成为孢子的气生菌丝存在有死亡现象。

留的残体既可以作为机械支撑用于气生菌丝分化从而脱离培养基表面，同时也可作为水分和营养物质的运输通道。

基质菌丝向气生菌丝转变的过程中产生次级代谢产物。

意义：

链霉菌发育分化和次级代谢产物的合成一般都是起始于对环境中营养匮乏的感应。

形态分化

（形态分化过程）营养生长阶段，基质菌丝经过顶端生长和分支，在感受到环境中的营养限制或者其他压力后，为了应对胁迫，通过bld基因的级联信号通路产生疏水分子SapB，从而赋予菌丝表面疏水特性而使其突破培养基表面的气-水张力进入繁殖性的气生菌丝阶段；然后在whi基因等的级联信号通路控制下产生孢子，孢子成熟后飘落到适宜的环境中再进行上述过程生活。

这种形态分化过程可以赋予链霉菌抵御环境胁迫的能力。

进行生殖生长产生气生菌丝和孢子，成熟孢子随风或其他生物被带到更加适宜其生活的环境中，对于链霉菌自身是十分重要的生活方式，使之区别于其他的原核生物。

次级代谢

（1）次级代谢产物的合成利用初级代谢的某些中间体，可避免其过量积累对机细胞产生的毒害作用。

（2）细胞死亡可为孢子的形成提供营养物质，伴随着基质菌丝向气生菌丝的转变，链霉菌通常会在这一时期产生抗生素，这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。

第二章第三节棒杆菌的分子遗传与代谢

１、如何通过组合生物合成获得新结构活性化合物？

1、基于改变前体物的组合生物合成

是指在前体渗入到终产物之前通过基因工程技术将其改变，然后将内源生成的修饰后前体物掺入到化合物中，形成新的化合物或其衍生物。

（1）前体定向组合生物合成：

利用NRPS或PKS的底物宽容性，通过在发酵过程中添加一些修饰后的前体物产生新型化合物或衍生物的过程。

（2）突变组合生物合成：

将某一前体的生物合成途径阻断，然后在该阻断突变株中添加前体类似物产生新型化合物或衍生物的过程。

2、基于化合物后修饰基因的组合生物合成

利用外源的后修饰酶能够扩大代谢产物的结构多样性。

包括基于卤化酶、羟化酶P450、甲基化酶或氧甲基化酶、酰化酶以及糖基化酶基因的组合生物合成。

3、基于主骨架合成基因突变的组合生物合成

（1）聚酮化合物的组合生物合成

a.改变DEBS组成模块（如减少、添加和替换等）产生新结构化合物

b.改变DEBS的结构域合成新结构化合物

c.同时改变DEBS的模块和结构域，合成新型聚酮化合物

d.改变PKS（聚酮合酶）的后修饰酶或者添加底物类似物，合成新结构化合物或衍生物

（2）非核糖体肽化合物的组合生物合成

a.NRPS亚基/模块/亚结构域/结构域的替换

b.NRPS模块/结构域的删除与插入

c.NRPS结构