利用Acc1基因和 trnLF序列探讨赖草属六个物种.docx
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利用Acc1基因和trnLF序列探讨赖草属六个物种
利用Acc1基因和trnL-F序列探讨赖草属六个物种
的系统关系及其母本来源
生物科学2003级吴莉
指导老师周永红教授
摘要:
本研究利用质体乙酰辅酶羧化酶基因(Acc1)对赖草属六个物种(Leymuskarlinii、L.angustus、L.racemosus、L.arenarius、L.triticoides、L.ambiguus)与Psathyrostachys、Pseudoroegneria、Thinopyrum、Lophopyrum部分物种进行了比较分析。
利用叶绿体trnL-F序列构建了赖草属这六个物种与小麦族19个不同基因组组成的二倍体属植物系统发育树,探讨赖草属六个物种的母本来源。
Acc1基因分析结果表明赖草属六个物种与Psathyrostachys物种聚为一支,而Pseudoroegneria、Thinopyrum及Lophopyrum植物聚为另一支。
trnL-F序列分析结果显示赖草属六个物种与Psathyrostachys植物形成一支,而另一支包括其它18个基因组的二倍体物种。
基于Acc1基因和trnL-F序列数据,可以推测:
(1)赖草属六个物种含有新麦草属的Ns基因组;
(2)赖草属Xm基因组与Eb、Ee、St基因组存在较大的差异;(3)赖草属六个物种母本来源于新麦草属。
关键词:
赖草属,系统关系,质体乙酰辅酶羧化酶基因(Acc1),叶绿体trnL-F序列
Phylogeneticrelationshipsandthematernaldonor
ofsixLeymusspeciesbasedonthenuclearAcc1gene
andchloroplasttrnL-Fsequences
WULiBiologicalScience,Grade2003
DirectedbyZHOUYong-Hong(Prof.Ph.D)
Abstract:
ThephylogeneticrelationshipsamongsixspeciesofLeymus(L.karlinii,L.angustus,L.racemosus,L.arenarius,L.triticoides,L.ambiguous)andsomespeciesofPsathyrostach,Pseudoroegneria,ThinopyrumandLophopyrumwereinvestigatedusingthesequencesofasingle-copynucleargeneencodingplastidacetyl-CoAcarboxylase.ToestimatethematernaldonorofLeymusspecies,sixLeymusspeciesandmonogeneticdiploidrepresenting19genomeswereusedtocreatephylogenetictreebasedonthechloroplasttrnL-Fsequences.InAcc1genedataanalysis,twocladeswereshowed.OnecladeincludedthespeciesofLeymusandPsathyrostachys,whiletheothercladecomprisedthespeciesofPseudoroegneria、ThinopyrumandLophopyrum.OnthebasisoftrnL-Fsequencesdata,twogroupswerealsoshowed.OnecontainedLeymusandPsathyrostachysspecies,whiletheotherconsistedofthemonogeneticdiploidrepresenting18genomesspecies.Itisconcludedthat
(1)LeymusspeciescontainstheNsgenomefromPsathyrostachysspecies;
(2)theXmgenomeofLeymusisdifferentfromtheEb,EeandStgenome;(3)thematernaldonorofLeymusisthespeciesofPsathyrostachys.
Keywords:
Leymus,Phylogeneticrelationships,Plastidacetyl-CoAcarboxylasegene(Acc1),chloroplasttrnL-Fsequences
1前言
1.1赖草属植物的分类历史
赖草属LeymusHochst.是小麦族TriticeaeDumort.一个重要的多年生属。
该属最早由Hochstetter提出并以L.arenarius(L.)Hochst.(Elymusarenarius)为模式种建立的属[1]。
Nevski将披碱草属Elymus的E.giganteus和E.mollis组合到赖草属中,成为L.racemosus和L.mollis[2]。
Pilger进一步扩大了赖草属,根据颖钻形、具短而硬的芒等特征,将Nevski置于Aneurolepikium和Malacurus中的相应物种组合到赖草属中[3]。
按照Pilger的观点,可根据形态特征将赖草属和小麦族其它众多物种区别开来。
他把赖草属的形态特征描述为:
具根状茎的禾草;叶片较硬;穗轴节不明显;颖狭窄,坚硬,偏离;外稃无芒或具短芒;花药较长。
一些赖草属物种不具有上述全部特征,但具有上述的大多数特征。
染色体组资料也强有力地支持了Pilger关于赖草属界限的解释。
以后的许多学者耿以礼[4]、Tzvelev[5]、Barkworth和Atkins[6]都延续Pilger关于赖草属的分类系统。
Tzvelev[5]从Elymus、Aneurolepidium和Malacurus三属中,将那些具有长花药、异花授粉习性和根状茎种组合到赖草属中。
并根据颖形状、外稃先端、外稃背部、每穗轴节小穗数、叶背特征、生活习性等特征将赖草属划分为Sect.LeymusHochst.、Sect.Anisopyrum(Griseb.)Tzvel.Sect.Aphanoneuron(Nevski)Tzvel.和Sect.Malacurus(Nevski)Tzvel.四个组。
Barkworth和Atkins[6]整理了北美洲的赖草属植物,描述了北美赖草属植物的特征及分布。
他们认为北美赖草用Tzvelev[5]的分类形态特征不能区分Sect.Anisopyrum(Griseb.)Tzvel.、Sect.Aphanoneuron(Nevski)Tzvel.,从而将上述两组植物组合为Sect.Anisopyrum(Griseb.)Tzvel.。
同时指出赖草属中还有许多种间类型和种下的分类问题需要进一步研究。
1.2赖草属植物的形态特征和地理分布
赖草属植物已作为一个独立的属,并具有自己的形态特征。
它拥有横走或直伸根状茎;秆直立,茎杆基部常被枯老碎裂成纤维状的叶鞘所包围:
叶扁平或内卷,质地较硬;穗状花序顶生,直立;小穗1至数枚生于穗轴各节,脱节于颖上,小穗有2至数小花;小穗轴扭转,致使外稃的位置有些移动或与颖交叉排列,使外稃背部裸露;颖锥刺状、披针形或窄披针形,有3~5脉,为锥刺状者仅具1脉;外稃披针形;先端渐尖,无芒或具小尖头;内稃脊上具细刺毛或无毛;花药较长;子房被毛;颖果扁长圆形。
赖草属植物均为异源多倍体,四倍体至十二倍体类型均有。
赖草属植物大约有30个种和19个亚种,从北海沿岸地区,越过中亚到东亚再到阿拉斯加和北美西部直至中美到南美洲南部的广阔地域均有分布,其中模式种L.arenarius间断分布于北极温带、南美洲南部及澳洲地域,其它多数种类集中分布于中亚和北美高山。
我国原记载约10个种,加上近年来报道的赖草新分类群[7-12],至今为止,先后报道我国有赖草属植物25个种,4个亚种和3个变种,主要分布于新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙、东北三省、四川、陕西、山西、河北及北部沿海地区。
1.3赖草属植物的生境及优良特性
赖草属植物生境极其多样,从湿润的盐碱地和海滨滩地到干旱高温的沙土草原,荒漠化草原,从种植各种作物的田间路旁一直到高寒山区的石坡、卵石滩等不同的生活环境皆能生长。
赖草属植物有较强的适应性和抗逆性,主要表现在两方面。
它不仅对非生物因素有抵抗力,如:
耐盐碱,耐贫瘠、耐旱耐寒,耐风蚀、耐污染、耐沙埋等;还对不良的生物因素有一定的抵御性,如:
抗叶、条、秆锈病,抗赤霉病,抗蚜虫。
除了上述的优点外赖草还有其自身的优良性状,包括其穗长、粒大且多、光能利用率高。
该属物种多数为草原和草甸的主要成分,许多种也是优良的牧草。
因此,作为麦类作物和牧草育种的重要三级基因源具有较高的应用前景。
1.4赖草属植物的细胞学研究
细胞学研究表明赖草属植物含有两个基本染色体组:
一个是来自Psathyrostachys的Ns染色体组;而另一个染色体组的来源目前还无定论[13,15,16]。
关于赖草属植物的另一个染色体组,Shiotani[17]认为是来自Pseudoroegneria的St基因组;Löve[18]认为是来自Thinopyrumbessarabicum的Eb基因组;Zhang和Dvorak[19]认为是来自Psathyrostachys的Ns基因组;Wang和Jensen[20]认为是未知来源的Xm基因组,而不是J(Eb)基因组。
因此,Wangetal.将赖草属的基因组组成命名为NsXm[20]。
1.5乙酰辅酶A羧化酶基因
植物有两类乙酰-CoA羧化酶(ACCase):
一类是位于质体中的质体ACCase,催化长链脂肪酸的合成;另一类是位于细胞质中的胞质ACCase,主要为长链脂肪酸和一些重要次生代谢产物的合成提供丙二酰-CoA和丙二酸。
禾本科植物质体ACCase由祖先胞质ACCase经复制进化而来,它属真核起源型,其它植物的质体ACCase属于内共生起源型[21]。
Southern分析表明六倍体小麦质体ACCase基因(Acc1)由单个基因编码,被定位在染色体短臂普通小麦第二同源群上[22]。
对小麦族Aegilops/Triticum复合群物种的序列分析也表明Acc1基因在大多数二倍体物种以单拷贝形式存在[23]。
编码六倍体小麦质体ACCase的基因约1.5kb并且有30个左右内含子的细胞核基因,内含子的大小是导致整个基因大小变化的因素。
Acc1基因已被成功用于小麦族植物、柳枝黍(PanicumvirgatumL.)的系统与进化关系研究[23-25]。
1.6叶绿体基因组trnL-F序列
叶绿体基因组(cpDNA)适合于植物系统和进化研究。
首先,cpDNA在植物总DNA中的含量相当丰富,易于提取和分析;其次,有着较小基因组大小(120-220kb),很容易通过限制性内切酶位点分析检测整个基因组;第三,叶绿体基因组的大多数基因基木上为单拷贝基因,有利于系统学研究。
用于植物系统与进化研究的叶绿体基因组序列包括编码区和非编码区序列。
叶绿体编码区的核酸替代速率相对较低,为植物深层次系统进化研究提供了合适的途径。
cpDNA非编码区包括内含子和基因间区,与编码基因相比,其功能上的限制较小,在核酸替代、插入、缺失突变上都表现出更快的进化速率,能提供更多的系统发育信息位点,多用于较低分类阶元或近期分化类群间的系统学研究。
分子系统学研究中应用最多的cpDNA非编码区主要有rpL16内含子序列、rpS16内含子序列、trnK-matK-trnK序列以及trnL-trnF序列。
trnL-trnF序列是编码trnL(UAA)与trnF(GAA)基因间的一段非编码区序列。
在小麦族植物分子系统学研究中,trnL-trnF序列作为一个有效的叶绿体基因组基因位点,成功地探讨了披碱草属植物系统关系及异源多倍体的母本供体[26,27]。
1.7本研究目的
本研究利用单拷贝的细胞核Acc1基因对赖草属植物六个物种(Leymuskarlinii、L.angustus、L.racemosus、L.arenarius、L.triticoides、L.ambiguus)和Psathyrostachys、Pseudoroegneria、Thinopyrum及Lophopyrum二倍体物种进行系统发育重建,旨在探讨这六个赖草属植物与Psathyrostachys、Pseudoroegneria、Thinopyrum和Lophopyrum间的系统关系。
利用叶绿体trnL-F序列对这六个赖草属植物和小麦族二倍体植物构建系统发育树,旨在探讨它们的母本来源。
2材料和方法
2.1材料
本研究所用的材料见表1。
PI编号的材料来自于美国国家种质资源库(NationalGermplasmRepositiories,USA)。
所用材料栽种于四川农业大学小麦所多年生苗圃,凭证标本保存于四川农业大学小麦研究所植物标本室(SAUTI)。
表1供试材料
Table1Plantmaterialsusedinthisstudy
种名
Species
基因组Genome
编号
Accession
登录号GenbankNo.
Acc1trnL-F
AegilopsuniaristataVis
N
G1297
AF519114*
AegilopsspeltoidesTausch
S
Morrisons.n.
AF519112*
AegilopstauschiiCoss.
D
Morrisons.n.
AF519113*
Aegilopsmarkgrafii
C
AF519111*
Pseudoroegnerialibanotica(Hackel)D.R.Dewey(isolate2)
St
PI228391
AF519156*
Pseudoroegneriaspicatassp.inermis(Scribn.,andJ.G.Smith)Á.Löve(isolate2)
St
PI236681
AF519157*
Pseudoroegneriastrigosassp.aegilopoides(Drobov)Á.Löve(isolate1)
St
MA-109-31-50
AF519155*
Pseudoroegneriaspicatassp.spicata(isolate4)
St
D2844
AF519159*
Pseudoroegneriaspicata(Pursh)Á.Lövessp.Spicata(isolate3)
St
AF519158*
Agropyroncristatum(isolate2)
P
PI281862
AF519116*
Agropyroncristatum(L.)Gaertn(isolate1)
P
C-3-6-10
AF519115*
AgropyronmongoliumKeng
P
D2774
AF519117*
Australopyrumretrofractum(Vickery)Á.Löve
W
Crane86146
AF519118*
Australopyrumvelutinum(Nees)B.K.Simon
W
D2873-2878
AF519119*
表1供试材料(续)
Table1Plantmaterialsusedinthisstudy(continued)
种名
Species
基因组Genome
编号
Accession
登录号GenbankNo.
Acc1
trnL-F
Haynalldiavillosa(isolate1)
V
AF519128*
Haynalldiavillosa(isolate2)
V
AF519129*
SecalemontanumGuss.isolate1
R
PI440654
AF519161*
SecalecerealeL.
R
Kelloggs.n.
AF519162*
HordeumbulbosumL.
H
PI440417
AF519122*
Hordeumbogdanii
H
AJ969267*
HordeumbrachyantherumNevski(isolate1)
H
PI531764
AF519120*
Heterantheliumpiliferum(Banks&Sol.)Hochst.
Q
PI402352
AF519153*
Henrardiapersica(Boiss.)C.E.Hubb.
O
H5556
AF519152*
Eremopyrumbonaepartis(Spreng.)Nevski(isolate1)
F
H5554
AF519148*
Eremopyrumdistans(C.Koch)Nevski
F
H5552
AF519150*
Eremopyrumbonaepartis(isolate2)
F
H5569
AF519149*
Peridictyonsanctum(Janka)Seberg.Fred.,&Baden
Xp
KJ248
AF519154*
TriticumbaeoticumBoiss.
A
Morrisons.n.
Taeniatherumcaput-medusae(L.)Nevski
Ta
MB-106-41-79
AF519164*
Thinopyrumbessarabicum(Savul.&Rayss)Á.Löve
Eb
PI531711
AF519165*
Lophopyrumelongatum(Host)D.R.Dewey
Ee
PI531719
AF519166*
Leymuskarelinii(Turez.)Tzveley
NsXm
PI598529
DQ319182*
Leymusangustus(Trin.)Pilger
NsXm
PI440308
DQ319179*
Leymusracemosus(Lam.)Tzveley
NsXm
PI531811
Leymusarenarius(L.)Hochst.
NsXm
PI272126
DQ319177*
Leymustriticoides(Buck.)Pilger
NsXm
PI516194
Leymusambiguus(Vasey&Scribner)D.R.Dewey
NsXm
PI531795
DQ319178*
Psathyrostachysfragilis(Boiss.)Nevski
Ns
C-46-6-15
AF519169*
PsathyrostachyshuashanicaKeng
Ns
PI531823
DQ335577*
Psathyrostachysjuncea(Fisch.)Nevski
Ns
PI206684
DQ335578*
AF519170*
BromuscatharticusL.
AY829228
LoliumrigidumL.
AF343457*
带有“*”的GenBank编号表示来自于GenBank(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
2.2方法
2.2.1DNA的提取
DNA的提取所用的是改良的CTAB法[28]。
(1)取1~2g嫩叶,将其放入研磨钵中,加入适量液氮迅速将叶片研磨至细,转移到干净的50ml离心管中;
(2)加入等体积预热至65℃的2×CTAB到离心管中,轻摇混匀;
(3)将离心管置于65℃水浴锅中,水浴40min,其间轻摇混匀几次;
(4)待离心管冷却至室温后加入等体积氯仿:
异戊醇(24:
1)溶液,上下颠倒轻摇混匀,直到上清液呈乳白色或牛奶状;
(5)放入离心机中以8000rpm离心10min。
(6)用移液枪轻轻吸出上清液至另一干净的50ml离心管中,加入等体积的-20℃预冷的异丙醇,轻摇2~3次,-20℃条件下静置数小时,挑出DNA;
(7)用70%酒精洗涤DNA沉淀两次,无水乙醇洗涤DNA沉淀一次;
(8)将DNA溶于适量TE(pH8.0)中,-20℃保存备用;
(9)电泳检测或紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。
2.2.2PCR扩增
2.2.2.1Acc1基因
(1)Acc1基因的PCR反应体系:
50µl
ddH2O30.7µl
ExBuffer5µl
Mg2+4µl
dNTP4µl
P11.5µl
P21.5µl
DNA3µl
ExTaq酶0.3µl
试剂的加入在冰上操作,完成后瞬时离心置于PCR仪。
引物序列分别为P1:
5’-CCCAATATTTATCATGAGACTTGCA-3’,P2:
5’–CAACATTTGAATGAAThCTCCA-
CG-3’。
(2)PCR反应程序:
预变性温度:
94℃4min
变性温度:
94℃30s
35个循环
退火温度:
56℃30s
延伸温度:
68℃4min
68℃延伸15min
2.2.2.2trnL-F序列
(1)trnL-F序列的PCR反应体系:
25µl
ddH2O11.25µl
Exbuffer2.5µl
Mg2+2µl
dNTP2µl
F11µl
F21µl
DNA5µl
ExTaq酶0.25µl
在冰上完成试剂的加入后,瞬时离心放到PCR仪中。
引物序列分别为F1:
5’-CATTACAAATGCGATGCTCT-3’,F2:
5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’。
(2)PCR反应程序
预变性:
94℃5min
30个循环
变性:
94℃40s
复性:
60℃50s
延伸:
72℃2min
72℃下延伸7min。
PCR扩增完成后,加入适量的电泳指示剂(10×LoadingBuffer),混合均匀,在0.8%的琼脂糖胶60
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
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