生物技术制药实验指导.docx

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生物技术制药实验指导

目录

实验一植酸钙镁的制备……………………………………………….…2

实验二溶菌酶结晶的制备及活力测定………………………..………...5

实验三固定化细胞生产L-天冬氨酸……………………………………8

实验一植酸钙镁的制备

植酸钙镁又称菲汀，是种良好的营养药，具有促进新陈代谢、增进食欲和营养、助发育等作用。

适用于治疗神经系统各种疾病、血管张力减退、癔病、神经衰弱、佝偻病、贫血和结核病等。

一、化学结构和性质

化学名称为肌醇六磷酸酯钙镁盐，呈白色粉末，无臭，溶于盐酸、硝酸和硫酸，不溶于碱水。

植酸钙镁在高等植物中含量很丰富，玉米浸泡的水液可作为提取的原料，是生产玉米淀粉的副产品。

米糖和麦麸也可作为原料。

二、提取方法

1、以玉米浸泡液为原料的提取法

（1）技术路线

　　H2SO3（浸泡）石灰乳（中和）（干燥）

玉米——————→浸出液——————→沉淀物——————→植酸钙镁

70hPH5.4-5.860～80℃

（2）工艺过程

取净化玉米投入浸泡罐内，用0.3%亚硫酸溶液在52~53℃浸泡70小时,放出浸液，搅拌下加入8Be的石灰乳，中和至pH5.4~5.8,静置1h,除去上层清液,混浊液压滤,滤饼在60~80℃烘干。

对玉米质量计，总收率0.2~0.3%。

2、以植酸钙为原料的提取法

（1）技术路线

浓HCI（浸泡）NaOH（中和）（干燥）

工业植酸钙————→浸出液—————→沉淀物————→植酸钙镁

PH5.1通风

（2）工艺过程

按m（工业植酸钙）：

V（浓盐酸）：

V（氢氧化钠）：

m（活性炭）：

V（水）=1:

1:

0.625:

0.04:

8的配料比，投料取工业植酸钙溶于等量的浓盐酸中，加热使溶解，加入活性炭，加水稀释，过滤。

滤液在搅拌下，加入120g/L（12%氢氧化钠）溶液中和至pH5.1，析出沉淀，静置，检查pH，过滤，收集滤饼用水洗至氯离子合格为止，甩干，搓成小条状，通风干燥，得植酸钙镁。

对植酸钙质量计，总收率50%以上。

3、以麸皮为原料的提取法

（1）技术路线

植酸水溶液

HNO3

麸皮————

2h

HNO3（浸泡）石灰乳（中和）PH5（干燥）

麸皮渣————→浸出液————————→沉淀物—→植酸钙镁

5hNaOHPH7

（2）工艺过程

取麸皮加入4倍量的水和0.02倍量的硝酸（相对密度1.4~1.42）,搅拌均匀浸2h,搅拌，取出植酸水溶液，麸皮再加入3倍量水和0.01倍量的硝酸，浸泡5h，搅拌，放出植酸水溶液，合并，pH4。

加入右灰乳（100g/L）调节pH5.0~5.5，再用NaOH（10%）调pH7，静止分层，去上层清液过滤，甩干，干燥，得粗品，对麸皮计，总收率3%~3.5%。

三、试剂和器材

1、试剂

硝酸（相对密度1.4~1.42）

米糠或麦麸

NaOH

石灰

pH试纸（1~14）

2、器材

烧杯500ml2个

玻棒2个

量筒250ml2个

玻璃漏斗10cm1个

布氏漏斗10cm1个

滤纸

真空泵1台

真空干燥箱1台

移液管5ml、10ml2支

天平

搅拌器1台

四、操作过程

1、原料称取及溶液配制

称取麦麸100克，配制10%NaOH和右灰乳（100g/L）。

2、提取

米糠100克加400ml水和0.02倍量硝酸,搅拌2小时。

取上清液。

残渣加400ml水和0.01倍量硝酸,取上清液,合并两次上清液，抽滤去除杂质。

3、沉淀

上清液加石灰乳调pH5，用10%NaOH调pH7，静止，完全澄清后去上清液。

4、抽滤干燥抽滤后置于干燥箱中85度干燥12小时。

5、称重计算收率。

并用适当的方法检验主要杂质。

作业：

1、计算收率

2、分析产品中的杂质有哪些，可用何种方法检验？

实验二溶菌酶结晶的制备及活力测定

溶菌酶E、C、3.2.2.7是糖苷水解酶，分子量14307，由129个氨期酸残基构成。

由于其中含有的碱性氨基酸残基比酸性氨基酸残基多，所以它的等电点高达11左右。

所有的细菌都有坚韧的细胞壁。

革兰氏阳性细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖。

它是由N-乙酰葡萄胺与N-乙酰胞壁酸（NAM）靠β-1，4糖苷键形成骨架，并通过NAM部分的乳酰基与寡肽交联而成。

溶菌酶能破坏革兰氏阳性细菌的细胞壁而具有溶菌作用，原因在于它能水解N-乙酰葡萄胺与N-乙酰胞壁酸（NAM）之间的β-1，4糖苷键。

溶菌酶在蛋清中含量较高，在一定条件下能直接从蛋清中结晶出。

蛋壳膜中的溶菌酶含量虽然较少，但仍可以用于制备，此外在哺乳动物的唾液、泪、乳汁、体液中存在。

一、原理

以蛋清为原料制备溶菌酶，因溶菌酶为碱性蛋白，在近中性环境中为阳离子交换树脂吸附。

利用该性质，可将它和蛋清中的其它蛋白质分离，然后再经盐析、纯化处理所得到的溶菌酶结晶。

结晶形状有棱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。

溶菌酶的活力测定采用比色法。

本法是以活性染料艳红K-2BP所标记的溶性微球菌Micrococcuslysodeikticus作为底物。

当溶菌酶将这种底物水解以后即产生染料标记的水溶性碎片，除去未经酶作用的多余底物，溶液颜色的深浅就能代表酶活力的相对大小，在540nm波长处可直接进行比色测定。

本法简便，准确。

二、试剂和器材

（一）试剂

1.724型弱酸性阳离子交换树脂；2.0.5MpH6.5磷酸缓冲液;3.聚乙二醇（分子量6000）;4.固体硫酸铵;5.10%（NH4）2SO4;6.溶菌酶标准品;7.葡聚糖凝胶G25;8.1NNaOH;9.1NHCI;10.丙酮11.五氧化二磷12.精密pH试纸13.固体NaCI;

14.溶菌酶底物;取1克艳红K-2BP标记溶性微球菌Micrococcuslysodeikticus悬于100ml0.5MpH6.5磷酸缓冲液内置冰箱保存备用

15.乳化剂:

2克Brij-35（聚氧乙烯脂肪醇醚）加50ml蒸馏水微热使溶解,冷却后定容至100ml吸取此液10ml,用0.6MHCI定容至200ml备用。

（二）器材

1.烧杯250ml2只500ml和1000ml各1只

2.玻璃漏斗3ml1只5ml1只

3.量筒100ml1只

4.镊子1把

5.玻棒2根

6.纱布10×20cm

7.磁力搅拌器1台

8.吸滤纸500ml1只

9.布氏漏斗8ml1只

10.200克药物天平

11.乳钵10cm

12.牛解匙

13.透析袋2×15cm

14.皮筋

15.刻度离心管10cm

16.显微镜

17.普通离心机

19.722分光光度计

20.冷冻干燥机

三、操作方法

1．蛋清准备

取2~3枚鲜鸡蛋，洗净察干，用镊子轻轻捣一直径4mm的小孔，下用烧杯接好，再在大头打一小针孔进气，此时蛋清缓慢流出。

取蛋清的操作应很轻避免蛋黄破裂混入蛋清而影响结果。

将所得80ml左右蛋清用磁力搅拌器充分打匀（约15分钟）。

打时用力不可过大，以防产生泡沫。

然后用纱布滤去杂质，测量体积（或质量），记录pH值，置冰箱冷却。

2．吸附

将处理好的724型树脂用布氏漏斗抽干，取相当蛋清四分之一重量的树脂在搅拌下加入冷却的蛋清，再继续搅拌2.5小时。

3．洗涤和洗脱

弃掉上层蛋清，每次用3倍量的蒸馏水洗树脂,至基本无泡沫为止,（约5~6）遍）抽干，用40ml10%（NH4）2SO4分两次搅拌洗脱，每次半小时，抽干。

4．盐析

合并洗脱淮，边搅拌边补加研细的固体硫酸铵至终浓度为40%，冰箱放置0.5-1小时,沉淀完全后离心收集。

5．脱盐

采用透析法：

将上述沉淀用1ml水分两次洗下，装入透析袋中，置冰箱用蒸馏水透析一天，中途换水三次，终体积应控制在2.5-3ml以内,否则用研细的聚乙本醇脱水浓缩。

6．去碱性杂蛋白

将上述透析液或洗脱液先用1NNaOH，后用0.1NNaOH溶液调至PH8.0-8.5,如有沉淀离心除去。

7．结晶

用骨勺在搅拌下慢慢向酶液中加入5%（W/V）研细的固体NaCI,注意防止局部过浓，加完后用0.1NNaOH溶液慢慢调至pH9.5~10.0,静置48小时。

8.肉眼观察至有结晶形成后，用滴管吸取结晶液1滴，置载玻片上，在低倍镜下观察并画出结晶形。

9．结晶收集

小心取出结晶液离收集结晶，用少量结晶冷丙酮分两次洗涤晶体，真空干燥得成品。

10．活力测定

活力单位定义：

在pH6.5,37℃条件下作用15分钟,水解0.1mg艳红K-2BP标记溶性微球菌Micrococcuslysodeikticus的酶量为一个活力单位。

（1）标准曲线的制作：

取试管6支按下表操作

管号

0

1

2

3

4

5

底物溶液（ml）

0.5MpH6.5磷酸缓冲液（ml）

溶菌酶溶液（ml）

0

0.5

0.5

0.1

0.4

0.5

0.2

0.3

0.5

0.3

0.2

0.5

0.4

0.1

0.5

0.5

0

0.5

37℃反应10分钟

乳化剂（ml）

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

3000r.p.m×10min离心后取上清液

A540值

注意:

底物的量吸量要准确;标准酶液中酶量是过量的,以保证水解完全

（2）样品测定

管号

0

1

2

底物溶液（ml）

0.5MpH6.5磷酸缓冲液（ml）

溶菌酶溶液（ml）

0

0.5

0.5

0.5

-

0.5

0.5

-

0.5

37℃反应10分钟

乳化剂（ml）

2.0

2.0

2.0

3000r.p.m×10min离心后取上清液

A540值

取平均吸收值由标准曲线查得单位数,再由稀释倍数加以换算求出溶菌酶活性。

实验三固定化细胞生产L-天冬氨酸

L-天冬氨酸是合成甜味剂肽的重要原料，可作为食品添加剂。

在医药应用方面，L-天冬氨酸是氨基酸输液的重要组成部分。

L-天冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起重要作用，适用于各种心脏病，对洋地黄等强心苷类中毒引起的心率失常有良好的疗效，能解除恶心、呕吐等中毒症状。

一、原理

工业生产以往采用化学合成法和微生物发酵法。

后改用含天冬氨酸酶的活性菌体直接将延胡索酸和氨转化成L-天冬氨酸。

本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶菌制成因定化细胞，制成生物反应器，生产L-天冬氨酸。

用卡拉胶可将酶或细胞固定于凝胶高聚物的网络中，且不影响酶和细胞的代谢活动。

用含有高含量的天冬氨酸酶，可将延胡索酸和氨转化成L-天冬氨酸：

天冬氨酸酶

HOOC-CH=CH-COOH+NH4-----------------------------HOOC—CH2—CH—COOH

︱

NH2

二、仪器和器材

水浴振荡培养箱1台

三角烧瓶250ml5台

离心机1台

恒温水浴1台

烧杯1000ml1只

500ml2只

250ml2只

小刀1把

磁力搅拌器1台

抽滤瓶1只

布氏漏斗2只

酶柱1根

超极恒温水浴1台

恒流泵1台

高压灭菌锅1台

三、试剂

菌种，玉米浆，延胡索酸，牛肉浸膏，KH2PO4，MgSO4·7H2O，浓氨水，氯化钾，Mg-Cl2，浓硫酸，95%乙醇等。

（标准L-天冬氨酸，延胡索酸）

四、操作过程

1、细菌培养、菌体制备

接种1ml对数期菌种至250ml三角烧瓶中，内含50ml经灭菌过的培养基（1%延胡索酸铵，2.5%延胡索酸铵，2%玉米浆，2%牛肉浸膏，0.5%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，ph7.0），37℃振荡培养24小时，培养液离心（3000r·p·m×20/）倾出上清液，再用生理盐水洗涤一次，离心收集菌体，置冰箱备用。

2、固定化细胞的制备

将4g湿菌体悬浮于生理盐水中，置45℃恒温水浴保温，0.8克卡拉胶于17ml生理盐水中，加热使之溶解，两者于45℃混匀，混合物置冰箱放置30分钟，将凝胶在100ml0.3MKCl溶液中浸泡4小时，然后，切成3×3×3mm2立方体颗粒。

经生过理盐水洗涤后，将固定化细胞置于1M延胡索酸铵（含1mMMgCl2pH8.5）中，于37℃活化72小时，即可使用。

3、

（1）湿菌体酶活力的测定

取4g克湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中，加入30ml1M延胡索酸铵，内含1mMMgCl2，1%TritonpH9.0,37℃搅拌反应30分钟，煮沸中止反应，稀释反应上清液于240nm处测定吸收值，按延胡索酸残余量计算酶活力，一个酶活力单位定义为在测定条件下，每小时转化生成1цm天冬氨酸所需的酶量。

（2）固定化细胞的酶活力测定

取相当于0.5克天然细胞的固定化细胞，置于30ml1.0M延胡索酸铵，内含1MMg-Cl2,37℃搅拌反应30分钟，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，经稀释后于240nm测定延胡索酸残余量，并计算每克固定化细胞的酶活力。

总活力用每克固定化细胞，单位小时内所产生的L-天冬氨酸的微摩尔数表示（цmol/h·g·cells）。

（3）延胡索酸（即富马酸）标准曲线的制备

延胡索酸在240nm处有特征峰吸收，在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系，且反应系统中无干扰。

标准曲线制备

1

2

3

4

5

6

延胡索标液

（50цg/ml）

0

1

2

3

4

5

蒸馏水

OD240nm

5

4

3

2

1

0

根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。

4、L-天冬氨酸制备

（1）6克固定化细胞装入带夹套的固定化生物反应器内（15×30nm），1.0M延胡索酸铵（含1MMMgCl2,pH9.0）底物，以恒流速度通过固定化细胞柱，SV=0.87h-1然后于240nm处测富马酸含量，计算酶的活力，计算转化率。

固定化酶的半衰期通过酶活力的衰变速度和工作时间的指数关系来确定。

（2）产品的制备

收集反应器流出液，80℃加热，冷却，用6NH2SO4调pH至2.8左右，置冰箱冷却，结晶，过滤，沉淀用95%乙醇漂洗，烘干，即得L-天冬氨酸。

五、实验要求

（1）菌体培养中，菌体的收率。

（2）培养完成后，湿菌体的活力。

（3）卡拉胶包埋后，固定化细胞的活力；包埋后，活力的回收率。

（4）制成生物反应器后，测定柱反应器的转化率。

（5）测定半衰期。

（6）制得产品。