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秦岭箭竹克隆多样性和克隆结构的SSR分析1
秦岭箭竹遗传多样性和克隆结构的SSR分析
马青青刘建军
(西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100)
摘要:
秦岭箭竹(Fargesiaqinlingensis)是佛坪国家级自然保护区内海拔1800-2600m林下的主要植被[1]。
本文利用SSR分子标记技术对佛坪自然保护区秦岭箭竹的克隆多样性和克隆结构进行初步分析。
结果表明:
1)7对SSR引物对秦岭箭竹2个居群共142个样本进行扩增分析,共得到79个位点,其中多态性位点77个,多态位点百分率(PPB)为97.47%,Shannon多样性指数(I)为0.2263。
2)AMOVA分析表明,较大的遗传变异来自居群内(70.49%),与基因分化系数(Gst=0.1418)的结果相同,两居群间有了中等程度遗传分化。
3)与其他克隆植物相比,秦岭箭竹克隆多样性水平较高。
基因型比率(PD)、Simpson指数和Fager均匀性指数(E)分别为0.7212、0.9127和0.5352,共得到107种基因型且没有共同的基因型,每个基株平均有1.5426个分株,最大基株跨度约为5m。
4)克隆结构分析表明,秦岭箭竹的构型为密集型。
关键词:
秦岭箭竹;克隆多样性;克隆结构;SSR
秦岭箭竹(Fargesiaqinlingensis)属禾本科竹亚科箭竹属,仅分布于秦岭地区,耐寒性强,较耐干旱贫瘠土壤,在海拔2000m上下有大面积纯林,有的绵延数公里至数十公里[2]。
秦岭箭竹具有地下茎合轴丛生的克隆生长方式[3],是一种典型的克隆植物[4]。
竹类长寿,开一次花和结一次籽,然而在没有区分无性系分株间的遗传结构时,不能确定是否同时开花。
已有研究表明竹子是以基株为单位开花的,由于基株交错或镶嵌生长,每个基株的开花时间间隔不同,因而一片区域内开花时间可以持续好几年[5][6]。
生长于林下的竹子占野生大熊猫食物来源的99%[7],秦岭箭竹是大熊猫夏季食物的主要来源[8],开花周期一般为50年[9],其大面积开花或死亡会直接造成大熊猫食物短缺。
1970年岷山缺苞箭竹和糙花箭竹的开花事件就导致了138只大熊猫的死亡[10]。
因此,对秦岭箭竹克隆多样性和克隆结构的研究对于高山地区的水土保持和环境防护[11]和大熊猫的保护具重要的生态意义。
虽然能够通过挖掘来判断竹子的克隆结构,但其地下茎的延展和裂断使得竹子的遗传结构很难被鉴别出来。
为了准确了解竹类的遗传结构,分子标记法已经被广泛的运用于竹类克隆多样性和克隆结构的研究中。
目前对于秦岭箭竹的研究主要集中在分类与分布、生物量、种子萌芽、幼苗生长、叶片光谱特性变化、无性系构件形态等方面,但是对其遗传多样性和克隆结构的研究还未见报导[2][12][13][14]。
本文利用SSR分子标记,初步探讨在巴山冷杉、红桦林下密集生长的秦岭箭竹的遗传多样性、克隆多样性和克隆结构。
1.材料和方法
1.1样地概况
佛坪国家级自然保护区内海拔1800~2600m为山地中温带,秦岭箭竹是该带林下的主要植被。
该带年平均气温2~6℃,最冷月平均气温-2~-9℃,最热月平均气温10~16℃,年降水量800~1000mm,冬长夏短,低温而湿润[15]。
本研究的采样地点位于佛坪国家级自然保护区的野猪荡,E107°50′40.4″、N33°41′50.2″,海拔约为2530m,此处秦岭箭竹密集地分布于巴山冷杉和牛皮桦林下。
1.2实验材料
为了确定初步的取样规模,我们于2013年8月进行预实验,样地命名为A。
首先设立5m×5m的格子以1m×1m为单位在交叉点上取样36个(a1),然后横向扩增同样大小的格子,参照5点法取样10个(a2),最后以5m×5m为单位向外扩大样地,并在交叉点上取样,最终形成30m×10m的矩形样地A,共计取样61个(图1(A))。
利用7对SSR引物对这61个样品进行克隆结构的分析,发现最大的基株跨度为5m,有的每个个体就是一种基因型。
为了进一步研究秦岭箭竹基株大小,2014年8月我们在离样地A约120m处设置了40m×40m的样地B(图1(B)),每隔5m定距取样,共得到样品81个。
由于秦岭箭竹地下茎合轴丛生,我们依据McClure的取样方法,认为每丛代表一个潜在的基株,每丛里的所有个体都是一个无性系分株[16],即每一丛竹子基因型相同,采样时摘取每一丛的一根竹子上的新鲜幼嫩叶片作为一个样品,最后将所有样品放入装有变色硅胶的塑封袋中干燥保存。
1.3研究方法
1.3.1总DNA的提取和检测
用植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA,用ddH2O将其稀释至50ng/μL,于-20℃保存。
具体操作按试剂盒提供的流程。
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
1.3.2引物筛选
从http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/下载秦岭箭竹DNA序列来设计引物,共设计出51对引物序列,由上海生工合成。
为了获得扩增条带清晰、多态性好并且反应稳定的引物序列,随机选取2个样品进行引物的首轮筛选,获得··对引物,然后从剩下的样品中随机选取10个进行第二轮筛选。
最后共筛选出7对多态性好且稳定的引物用于所有样品的扩增(表1)。
表17对SSR引物信息
Table1Informationof7polymorphicprimers
引物编号Primer
重复基序Repeatmotif
5'-3'端引物序列5'-3Primersequence
退火温度Annealingtemperature/℃
预期产物Expectedproductionsize/bp
035
(GA)11
GAGTCCTCCGCTCTGTGCAAT
AATTAATCACCCCATCTCCAAGC
58
155-193
003
(AG)9
TTACACCGCGAGCCGTCCATC
AATGCACTGTCATGATCCGCAAC
59
169-226
008
(TG)9
AGAAAGATAGGGATAGTGATTGTGTTCCGAGGTGAAAAAGGAGGAACT
57
182-201
012
(AG)9
GAGAGTGCCAAGAGACCACTG
CTCACACACGCACACAACACAAA
58
135-180
022
(GA)11
ACGTGTTAGCTCGGTTCGACTG
TTCTCTTCCTCCCTACATCGTCT
59
168-226
934
(TA)6
ACGGAACGGTACAATATATGCT
TCTTGCCTTCTATGATGGTGTC
55
162-172
306
(TC)11
GCCGTCCAAACGCTCCTT
CACCCATCCATCTTATGCTAT
52
257-279
1.3.3SSR-PCR反应体系
PCR反应体系为20μL反应体系,包括2×PCR缓冲液、50ng模板DNA、0.16mmol/LdNTP、1.2mmol/LMg2+、0.2μmol/L引物和1.0UTaqDNA聚合酶。
1.3.4PCR扩增体系
PCR反应在美国Bio-RAD公司生产的MyCyclerThermalCycler#170-9701EDU型PCR仪上进行。
94℃预变性5min,55℃左右退火(依引物不同而异)45s,72℃延伸45s,进行30个循环,72℃延伸5min后在4℃保存。
所有样品DNA交由上海生工做毛细管电泳。
1.3.5扩增产物检测
用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,以100bpDNALadder(康为世纪)作为对照对PCR扩增产物进行检测。
在DYY-6C型电泳仪(北京六一公司)上,稳压(5V·cm-1),电泳2.5h后银染检测扩增效果。
1.3.5数据分析
毛细管电泳得到的结果为扩增产物的bp值,所有引物扩增bp值相同的样品为同一个基因型。
由于供试材料均为同源四倍体,利用SSR标记难以辨别杂合基因型,故本研究将SSR标记不进行基因型判定,而是利用盖红梅SSR数据处理宏程序DataTrans1.0将原始bp数据转化为0、1矩阵[17]。
我们运用下列指数对克隆多样性进行分析(Ellstrand&Roose1987)[18]:
1)平均克隆大小(N/G),即所有样本中基因型相同的为同一基株,G就是种群中基株总数,N就是样本总数。
不同基因型比率(G/N)
2)Simpson多样性指数(D),最初用来衡量物种的多样性和均匀度,现用于分析种群的克隆多样性。
式中,Ni表示第i个基因型的基株数,N表示样本大小。
D从0到1变化,D为0表示整个居群是相同的基因型;D为1表示居群内每个样品的基因型各不相同。
3)Fager指数(E)(Fager1972),表示种群内不同基因型分布的均匀度。
其中,
,
式中,E从0到1变化,E为0表示整个种群只有一个基因型或有一个基因型占据主要优势而其他基因型各包含一个样品;E为1表示种群内不同基因型有相同的样本。
用POPGENEv1.32软件计算遗传多样性参数,包括多态位点百分率(PPB)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon多样性指数(I)、种群总遗传多样性(Ht)、种群内遗传多样性(Hs)、Nei’s群体遗传分化系数(Gst)、基因流(Nm)、Nei’s遗传多样性指数(H)、Nei’s遗传一致度和遗传距离(D)。
为了解种间亲缘关系,基于Nei’s遗传距离。
运用NTSYS-PC2.1软件通过计算Nei遗传相似性系数,对秦岭箭竹进行UPMGA非加权算术平均(Unweightedpair-groupmethodanalysis)聚类并利用主坐标分析(PCOA)加以验证。
用Arlequinver3.5.软件对种群内和种群间的遗传变异进行AMOVA方差分析。
2.结果与分析
2.1秦岭箭竹的SSR遗传多样性和遗传分化
从设计的51对引物中筛选出7对对秦岭箭竹的142个样品进行PCR扩增,在物种水平上,7对引物共检测到79个位点,多态性位点77个,多态位点百分率(PPB)、Nei’s遗传多样性指数(H)、和Shannon多样性指数(I)分别为97.47%、0.1323和0.2263,说明秦岭箭竹居群的遗传多样性较高。
在居群水平上,居群A和B的多态位点百分率(PPB)分别为46.84%和96.47%,Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon信息多样性指数(I)分别0.0954和0.1282,0.1494和0.2299,说明居群B的遗传多样性略高于居群A。
表2秦岭箭竹居群的遗传多样性
Table2GeneticdiversityintwopopulationsofFargesiaqinlingensis
居群Population
总位点Totalnumberofloci
多态性位点Numberofpolymorphicloci
多态性位点百分率Percentageofpolymorphicloci(PPB)
Nei's遗传多样性指数Nei'sgenediversity(H)
Shannon's多样性指数Shannon'sinformationindex(I)
基因流Geneflow(Nm)
基因分化系数Coefficientofgenedifferentiation(Gst)
A
79
37
46.84%
0.0954
0.1494
B
79
76
96.20%
0.1282
0.2299
物种水平Species
79
77
97.47%
0.1323
0.2263
3.0265
0.1418
秦岭箭竹居群间的Nei’s遗传一致度为0.9586,遗传分化系数GST为0.1418(Gst>0.05),表明秦岭箭竹居群间有了中等程度分化,两居群的遗传多样性85.82%来自居群内部,14.28%来自居群间,居群间的基因流(Nm>1)为3.02659,说明居群间基因流动较大(表2)。
方差分析(AMOVA)表明秦岭箭竹有着极显著的遗传分化(p<0.001),70.49%的遗传分化发生在种群内,29.51%的遗传分化发生在居群间,说明秦岭箭竹的遗传变异主要来自居群内,验证了遗传分化系数(Gst)的结果(表3)。
2.2秦岭箭竹的克隆多样性
通过预实验,我们分析了样地A的61个样品,共发现30个基株,克隆大小为2.0333,最大基
株跨度为5m。
为了进一步验证秦岭箭竹基株的最大跨度和空间结构,我们以此为据在离样地约
表3秦岭箭竹的AMOVA分析
Table3Analysisofmolecularvariance(AMOVA)intwopopulationsofFargesiaqinlingensis
变异来源Sourceofvariation
自由度df
总方差Sumofsquares
变异组分Variancecomponents
变异百分率Percentageofvariation/%
P
居群间Variationamongpopulations
1
171.290
2.3797
29.51
P<0.001
居群内Variationwithinpopulation
140
795.964
5.6855
70.49
P<0.001
注:
p值通过对样本的1000次随机排列计算得到。
Note:
Levelsofsignificancewerebasedon1000permutations.
120m处,设计了另一块样地B(40×40m),以5×5m的格子为单位,在交叉点上取样81个,两居群间分布着大量裸露岩石。
发现样地B共有77个基株,平均克隆大小为1.0519。
两个样地没有发现相同的基因型。
居群A的不同基因型比率(G/N)为0.4918,Simpson多样性指数(D)和Fager均匀度指数(E)分别为0.8268和0.3854。
相应的,B居群的这些参数分别为0.9506、0.9986和0.7049。
秦岭箭竹平均基因型比率(G/N)为0.7212,Simpson多样性指数为0.9127,说明居群B比居群A有更高的克隆多样性(表4)。
表4秦岭箭竹居群的克隆多样性
Table4ClonaldiversityintwopopulationsofFargesiaqinlingensis
居群
Population
N
G
N/G
D
G/N
E
A
61
30
2.0333
0.8273
0.4918
0.3875
B
81
77
1.0519
0.9988
0.9506
0.7599
平均
Mean
71
54
1.5426
0.9130
0.7212
0.5737
注:
N,样本数;G基株数;N/G,平均克隆大小;D,Simpson多样性指数;G/N,不同基因型比率;E,Fager均匀度指数。
Note:
N,samplesize;G,numberofgenets;N/G,averagesizeofgenotypes;D,Simpson’sindexofdiversity;G/N,proportionofdistinguishablegenotypes;E,Fager’sevenness.
2.3秦岭箭竹的克隆结构
两个居群的克隆结构见图1,最大克隆约为5m(图1)。
用UPMGA对所有分株聚类发现(图2):
两个居群有较高的遗传相似性。
当相似性系数为1时,分株A1到A6,A8,A10到A20,A22到A25,A27到A29聚为一类(基因型1),A37,A39到A43聚为一类(基因型12),A54和A55(基因型30),B14和B15聚为一类(基因型43),B73和B74聚为一类(基因型107),B75和B76聚为一类(基因型106),B80和B81聚为一类(基因型102);当相似性系数约为0.82时,来自居群A的54个分株和B42、B56、B54、B69聚为一类,说明这4个分株与居群A有更高的遗传相似性,来自居群B的56个分株与A48、A51和A52聚为一类,说明这3个分株与居群B有更高的遗传相似性,居群B的25个分株并未与B居群的其余分株聚在一起,与B居群的其他分株相比,这些分株有了更大的遗传分化。
根据Nei’s遗传距离,对142个分株进行主坐标分析(PCOA)得出:
来自同一个居群的分株先聚在一起,与UPGMA结果相同(图3)。
图1秦岭箭竹两个居群的克隆多样性和空间分布
数字代表两个居群所采的分株,共142个;相同基因型的分株用相同数字表
Fig.1ClonaldiversityandstructureintwopopulationsofFargesiaqinlingensisinferredfromSimpleSequenceRepeat(SSR)fingerprintsNumbersindicatethesamplingrametsfromthetwopopulations,142inall;samplesbelongingtothesamegenotypearerepresentedbythesamenumber.
图2142份材料UPGMA聚类图
Fig.2UPGMAdendrogrambasedondicegeneticsimilaritiescalculatedfromSSRdataon142
ramtesofFargesiaqinlingensisaccessions
图3142份材料主坐标分析图
Fig.3Principalcoordinateanalysis(PCoA)basedongeneticrelationshipof142Fargesiaqinlingensisaccessions
3.讨论
3.1遗传多样性和遗传分化
Harper认为克隆植物的遗传多样性要低于非克隆植物[19]。
然而,也有研究表明克隆植物有较高的遗传多样性[20]再加几个例子)。
秦岭箭竹物种水平(0.2263)和居群B(0.2299)的遗传多样性与Nybom[21]基于RAPD、ISSR、AFLP等分子标记所统计的多种植物居群水平遗传多样性的平均值(0.22或0.23)大致相等。
居群A的遗传多样性(0.1494)与之相比略低,表明居群A内的遗传多样性略有不足,这可能是因为相比之下a1、a2样方取样尺度较小并且两个样方里各有一个基因型占主要地位,从而拉低了遗传多样性。
此外,SSR遗传标记法、竹子的觅养策略以及初期种苗补充也是保持秦岭箭竹较高遗传多样性的因素。
本研究中的两个秦岭箭竹居群在物种水平上有着中等程度的遗传分化(Gst=0.1418)。
AMOVA分析表明大多数遗传变异(70.49%)发生在居群内,只有很小的遗传变异(29.51%)导致居群间的变异。
秦岭箭竹中等程度的遗传分化可能是由于其长达50-60年的克隆繁殖、较大的基因流(Nm=3.02659>1)和体细胞突变[22]引起的。
UPGMA聚类分析和PCoA主坐标分析表明秦岭箭竹两居群间存在中等程度的遗传分化和较高的遗传相似性。
两居群的生境相同,居群之间仅由大片裸露的岩石地阻隔,这可能是导致上述结果的原因之一。
居群A的一些个体与居群B的一些个体首先聚在一起,这可能是由于在初期种苗补充时,风力、动物等因素影响了花粉或种子的传播,从而使这些分株有了更接近的起源。
3.2克隆多样性和克隆结构
克隆多样性由基株的死亡和补充比率来确定[23],在最初定居后的短时期内只有一些幼苗能够存活下来从而维持居群的克隆多样性[24],随之分株和基株间的竞争排斥或死亡会导致克隆多样性的降低[25],如果没有种苗重复补充,基株就会急剧减少,最后导致几个大的克隆的出现[26]。
然而,秦岭箭竹是多年生木质化竹子(woodybamboo),无性繁殖期很长,大约每50年开一次花结一次籽[9],然后死亡,再通过种子发育成新个体。
本研究中秦岭箭竹居群没有出现较大的克隆,大多数克隆(93.5%,100个克隆)只包括一个分株,并且有较高的遗传多样性和克隆多样性。
因此,秦岭箭竹在初始种苗补充对秦岭箭竹才遗传多样性和克隆多样性有很大贡献。
本研究中秦岭箭竹的克隆多样性较高。
Simpson多样性指数平均值为0.9130,不同基因型比率(G/N)平均值为0.7212,Fager均匀度指数(E)平均值为0.5737,高于与其它克隆植物的平均值(D=0.62,G/N=0.17,E=0.68)[18]。
两个居群都是多克隆的,并不是只由一个或者几个基因型构成(GA=30,GB=77)。
LovettDoust把克隆植物的生长策略分为游击型和密集型[27]。
而秦岭箭竹居群内不同基株镶嵌分布,基株内的分株紧密聚合,属于密集型空间分布格局。
取样方法和取样大小以及秦岭箭竹合轴丛生的生长方式都会影响克隆多样性。
在a1、a2样方中,由于取样尺度、取样数目较小,Simpson多样性指数为分别为0.4841和0.6666,不同基因型比率(G/N)分别为0.3055和0.5,Fager均匀度指数(E)均为0,a1和a2主要由基因型1和基因型12组成,属于同一基因型的分株密集地聚集在一起(图1)与其他克隆相比有很大不同。
环境异质性对克隆结构有很大影响[28]。
例如,华西箭竹的地下茎能够绕过交错的石头,在其夹缝之间的土壤里生长、延展,因而无法在贫瘠的土壤里密集生长[29]。
居群A、B由大片的裸露岩石分隔开,a1样地边缘的个体恰好处于居群A的边缘,但是分布过于密集的岩石限制了秦岭箭竹的生长空间,种苗只能在较小的空间内进行无性繁殖,地下茎很难延展,无法形成较大克隆,从而在很小的取样尺度内出现了很多基因型(基因型1、2、3、6、7、8、9、10、11)。
而在居群内只有零星的岩石、牛皮桦分布,地下茎能很容易地够绕过这些障碍密集生长,因而基因型1和基因型12有较多分株。
本文只是对秦岭箭竹的遗传多样性、克隆多样性和克隆结构的初步分析,对其克隆结构的动态变化还有待进一步研究。
参考文献
[1](DistributionandplantcommunityassociationsoftheunderstorybambooFargesiaqinlingensisintheFopingNationalNatureReserve,ChinaXi-ChunDu&YiRen&Gao-DiDang&JeremyLundholm,AnnalsofForestScience(2011)68:
1197–1206DOI10.1007/s13595-011-0104-0)
[2](陕西森林陕西森林编辑委员会编著西安中国林业出版社陕西科学技术出版社1989263页)
[3](秦岭大熊猫主食竹的分类学研究(Ⅰ)李 云1,任 毅1*,贾 辉2西北植物学报2003,23
(1):
127—129)
[4](不同生境秦岭箭竹人工种群的生长特性研
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