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黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸
黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸
()清华大学学报自然科学版15ƒ34()JournalofTsinghuaUniversitySci&Tech第6期第52,55页1998年第38卷
黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸
石忆湘,刘祖同
清华大学生物科学与技术系,北京100084
文摘用紫外线和亚硝基胍诱变相结合的方法,从野生黑使得一些柠檬酸生产企业无法承受。
而玉米粉资源曲霉菌株出发,经多次诱变筛选,得到一株能够较好地利用丰富、价格低廉,完全可能代替薯干进行发酵。
用玉玉米淀粉生产柠檬酸的黑曲霉菌株.95。
对.AnigerAniger米淀粉生产柠檬酸受到各方面的密切关注。
95在摇瓶和发酵罐上用玉米淀粉发酵产生柠檬酸的适宜条
1材料和方法件作了详细研究。
经过比较,认为摇瓶产生柠檬酸的适宜培
(养基配方及发酵条件为:
玉米淀粉20%均为质量分数,下1.1材料
)()同、2%、012%、70.rNH4SO4KH2PO4MgSO4H2O出发菌株本实验室保存的野生黑曲霉0.05%,甲醇3%,初始。
接种液体种子5%,30?
2003.0pH()菌株。
其柠檬酸产酸率不超过Aspergillusniger发酵7,柠檬酸产量1018%。
在6.6的2型ƒ?
rmindLBioflo2%。
发酵罐上设定30?
500,600ƒ,2.5,4.0,1.2rminpH
培养基斜面培养基、种子培养基:
麦芽汁培ƒ的通气量,发酵132,柠檬酸产量为913%。
可用价格Lminh
)(养基。
其他培养基的配方见表1为质量分数。
w低廉、来源丰富的玉米淀粉代替传统的薯干,作为发酵生产
柠檬酸的原料,为实际生产奠定了基础。
()()()摇瓶初筛1、复筛2和选定的3培养基配方表1
关键词黑曲霉;柠檬酸;玉米淀粉;发酵×100w分类号197939Q()()()成分123
蔗糖14--
玉米淀粉-1520柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸()NH42SO40.20.20.2之一,它的用途非常广泛,需求日益增长。
目前国内5KH2PO4柠檬酸年产量约215×10其中半数以上供出口,0.20.20.2t
7rMgSO4H2O之用。
从世界的需求来看,2000年总需求预计将达0.050.050.055到715×10左右,而目前世界柠檬酸总生产能力甲醇t--35约615×10ƒ缺口很大。
80年代,我国国内的柠,ta方法1.2檬酸消费急剧上升,速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高,对食品和饮料等含柠檬诱变方法紫外线诱变,亚硝基胍诱变酸制品的需求量猛增,但就人均消费量来看,我国的(培养方法取孢子刚刚成熟即30?
培养了2柠檬酸消费还是很低的,以用于食品和饮料的柠檬),3的.麦芽汁斜面,总计加入约30dAnigermL酸为例,1990年美国和日本的人均消费量分别为无菌生理盐水洗孢子,将洗下的孢子转移到种子培384和118,而我国则仅为20左右,市场潜力ggg养基中,30?
200培养约24,27。
此时.ƒrminhA巨大,因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益
在种子培养基中形成直径约1,2的菌球增长的需要,也是换取外汇的重要手段之一。
nigermm
体。
每瓶发酵培养基中接种5这样的液体种子,mL我国的柠檬酸生产主要以薯干为原料进行发
30?
发酵。
终止发酵后,过滤掉菌丝体,收集发酵液,酵。
由于近年来薯干粉大幅度涨价,生产成本增高,
进行产酸及其它分析。
分析方法酸度测定
取发酵滤液1,以酚酞为指示剂,用标准mL
011429滴定。
求得产酸率。
ƒmolLNaOH收稿日期:
1997201214
第一作者:
男,1970年生,硕士研究生纸层析法分析柠檬酸的纯度
()()()展开剂正丁醇?
乙酸?
水=120VVV
?
30?
50
()温度为25?
1?
上行2,3,显色剂为h
0104%溴酚蓝溶液,点样用10层析纸为新华一,ΛL
号滤纸,标准液使用012ƒ和012ƒmolLC6H8O7mol
。
LH2C2O4
还原糖的测定用费林法。
2结果
图2玉米淀粉用量对摇瓶发酵生产柠檬酸的影响2.1柠檬酸高产菌.95的获得Aniger
经紫外线和亚硝基胍多次诱变筛选,得到一株
能较好地利用玉米淀粉生产柠檬酸的变异株.A
(95。
该变异株摇瓶发酵产酸指发酵的混合物niger
)中酸的质量分数为8%以上,在以柠檬酸钠为唯w
一碳源的培养基培养7,未见明显生长。
经多次传d
代后,它的产酸能力稳定。
2.2用玉米淀粉发酵生产柠檬酸
)1.95发酵生产柠檬酸的时间曲线Aniger在图3甲醇添加量对产酸的影响同样的发酵培养基和发酵条件下发酵1,
19,得出产酸的时间曲线见图1。
d黑曲霉的柠檬酸产率。
其作用机理还不够清楚。
一
般认为它是改变膜蛋白的通透性,使得糖化酶更容
易分泌到细胞外,淀粉被降解后的小分子糖更容易
进到胞内,从而导致产生、积累更多的柠檬酸。
但其
>3%,对细胞造成毒害,使柠檬酸产量急剧下降。
w
)4三种营养添加剂的作用发酵培养基中分别
加入015%酵母膏、蛋白胨、
牛肉胨、牛肉膏,研究其对柠檬酸产率的作用。
实
验结果表明,酵母膏、蛋白胨、牛肉膏的产酸
分别为913%,918%及916%,与对照组917%比较
图1.95利用玉米淀粉发酵生产Aniger都对提高柠檬酸的产率作用不大。
柠檬酸的时间曲线)5几种碳源产柠檬酸能力的比较以红薯粉、粗
玉米粉、黄豆粉、花生饼粉、蔗糖、结果表明,由于黑曲霉产柠檬酸的过程是边糖
可溶性淀粉分别代替玉米淀粉进行产酸实验。
结果化边产酸,所以如果不事先将淀粉用酶解法或酸解
用红薯粉和蔗糖的产酸量基本与玉米淀粉相同,分法液化,则发酵周期约为7。
d
别为10123%,10108%和9161%,表明该菌种能利)2玉米淀粉对摇瓶发酵生产柠檬酸的影响
用新碳源玉米淀粉成为工业生产菌种。
改变发酵培养基中玉米粉的含量,研究其对柠
檬酸生产的影响。
结果示如图2。
2.3.95利用玉米淀粉发酵生产柠檬酸的Aniger
在一定的范围内,柠檬酸产量随着玉米粉含量发酵罐实验
用616美国出.LNewBrunswickScientificCo的升高而升高。
玉米粉含量为20%时产酸为
品的2型发酵罐。
发酵过程中定时取样,分?
Bioflo1018%。
此后不再升高。
析记录其中还原糖及柠檬酸产率,菌体生长形态及)3甲醇添加量对产酸的影响
()()清华大学学报自然科学版1998,38654
转入下一阶段。
)3()第三阶段110以后h
产酸速率降低,还原糖含量继续下降,溶氧开始
上升。
镜检发现孢子数量剧增,菌丝断裂、破碎,到
132时已基本上看不到菌丝。
h
132时发酵液中还原糖量仅剩013%。
因此停h
止发酵。
经计算,发酵结束时柠檬酸产量为913%,发酵
的转化率为85%。
图4发酵罐中柠檬酸生产的动力学曲线3讨论
())第一阶段0,401h用黑曲霉菌种进行柠檬酸发酵时,接种量的多
少,取决于进入培养系统的孢子数量,实验表明,接从图上看,这个阶段的特征是:
柠檬酸缓慢产
入的孢子数与形成的菌球体数为正相关关系,而与生;发酵液中还原糖量迅速上升,达到最高值;溶
孢子数量相差很远。
这是因为由于孢子之间的相互()氧分数溶氧迅速下降。
从外观上来看,发酵液明f
吸附,孢子在发酵液中萌发时,菌丝的互相缠绕等物显的由发酵起始时的相当粘稠状态,演变成完全流
理作用,多数情况下每个菌球体都由几个孢子乃至体化。
36镜检可见到大量菌丝。
通气量也由发酵h
一团孢子形成,实验表明,在一定范围内,向发酵培开始时的115ƒ上升到40时的215ƒ。
LminhLmin
养基中接入的孢子数量与产酸速率成正比。
在柠檬曲这一些现象都表明,这个阶段主要进行的是黑
酸生产过程中,黑曲霉的孢子发育成菌球体,不同于霉.95的菌体生长及增殖。
由于发酵前未Aniger
分裂增殖的细菌个体,因此由孢子进入生长过程,既采取任何专门的措施来糖化玉米淀粉,仅仅靠高温
()可以采用一级种子即把孢子直接接入发酵体系,灭菌115过程中附带进行的淀粉酸水解,因此发h
(酵起始时发酵体系中的还原糖量只有约2%,大量也可以进行二级种子培养即用种子培养基先把孢的淀粉还未被液化,发酵液显得相当粘稠,这也使得)子培养到一定形态的菌球体,再进入发酵体系。
本传氧更为困难,只能达到115ƒ。
接入较大量的Lmin文中采用二级种子的原因,是因为需要较为准确的黑曲霉.95后,由于其产生、分泌的各种糖Aniger控制同一批发酵液中接种黑曲霉孢子的数量,以利化酶作用,发酵体系中大分子的玉米淀粉迅速被降
解为小分子的还原糖,因此体系得以液化,通气量增
大,即传氧速率加快。
另一方面,.95经过短Aniger
于定性地分析各种发酵条件的改变对产酸的影响。
暂的延迟期后,开始大量生长增殖。
到这一阶段基
可以认为其接种的孢子数量若使用一级种子培养本结束时,发酵体系中还原糖量、
是相对过量的,而采用二级种子则难以达到这样的通气量、菌体数量都达到整个发酵过程中的最大值,
数量级。
因此使用一级种子培养应该可以有利于提为大量产生积累柠檬酸奠定了基础。
于是发酵过程
高产酸水平和产酸速度。
而且发酵液中黑曲霉作为进入第二阶段。
生产菌种的压倒优势也更能够有效地抑制杂菌生
长,使得最后的发酵结果不会受到明显的影响。
所以
后续工作中建议可考虑采用一级种子培养的方式。
)
(2)柠檬酸发酵是大量需氧的。
若通气量不足,生产第二阶段第40,110h
从动力曲线上看,这一阶段的特点是:
以比较菌的呼吸就受到抑制,甚至处于窒息状态。
由于淀粉
稳定的速率持续大量产生柠檬酸;还原糖量则不断过于粘稠,而且受温度的变化影响较大,具体地说,下降;溶氧虽然缓慢降低,但相对前两者来说变化在一定范围内,温度越低,粘度越大。
因此就很容易不是太大。
这一阶段的中后期,镜检发现产生孢子。
发生这种现象:
高压灭菌的过程中,淀粉液化,进入有了第一阶段的基础,.95开始进入稳Aniger并充满通气管;而灭菌后,这部分淀粉凝固,导致通定期,大量产生积累柠檬酸。
这一阶段虽然淀粉的糖气口被堵塞。
尽管采取了对策,但仍然未彻底解决问化可能仍在继续,但已经不能补偿消耗,因此发酵液题。
因此本应大量通气时却通气不足,这严重地影响中的还原糖量逐渐下降。
孢子的出现则反映出菌体了柠檬酸的产生和积累。
这大概就是发酵罐实验中,的生长环境已趋于恶化,这也预示了发酵过程即将产酸率反而稍低于摇瓶发酵的主要原因。
因为摇瓶
acidobtainedfrommediumcontaining20%cornstarch,发酵不存在堵塞通气管的问题,在转速、三角瓶规
()0.2%NHSO,0.2%KHPO,0.05%MgSOr7HO,4242442格、装液量、纱布层数等因素均固定时,可以认为其3%methanolandpH3.0isthehighestoneforcitricacid(通气量是固定的至少对于培养基表层来说是这productionontherotaryshakersetat30?
200rmin.ƒ
Theyieldsofcitricacidwere10.8%intheshakerincubated)样。
而扩大规模到发酵罐上,无论是实验室用的小withA.niger95for7daysand9.3%ina5literN.B.S.3发酵罐,还是实际生产中使用的容积约100的大mBioflo2?
fermentorunderconditionsof30?
500,罐,情况很不一样。
由于体积大,液面离罐底有很高1.5,pH4.0,andanairflowrateofƒmin,600r
2.5Lmin.ƒ的距离,因此仅靠表层的那些自然溶氧是远远不能for132h.85%sugarisutilizedinthe
Theresearchmakesitpossibletousecornfermentor.满足需要的。
要从根本上解决这一矛盾,可以采取的starch,whichischeaperandmoreabundant,asthemain办法有两个:
一是先将淀粉用酶或酸完全液化;二carbonsourceincitricacidproduction,inplaceofsweet
是以较低的初始淀粉浓度上罐,在发酵过程中用流potato.
加的方法逐渐补充营养。
这样就牵涉到一系列工艺()KeywordsAspergillusnigerA.niger95;citricacid;
cornstarch;fermentation和经济上的问题。
()参考文献上接51页
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hasbeenstudiedwithSpan2TweenorSpan2OPmixtureasusingcornstarch
emulsifier,Aliphatichydrocarbonasoilmediumandusing
redoxinitiator.Theinfluencesofvariousfactors,suchas,LIUZutongSHIYixiangreactiontemperatureandtime,pHvalueofwaterphase,
monomerconcentration,theratioofoilandwater,DepartmentofBiologicalScienceandBiotechnology,
monomerratio,theamountofcrosslinkingagentontheTsinghuaUniversity,Beijing100084,Chinainverse2emulsioncopolymerizationandthepropertiesofthe
productshavebeeninvestigatedindetail.TheobtainedAbstractCombinedtreatedbyUVandNTG,wildstrainproductshaveexcellentthickeningproperties.ofAspergillusnigerwasmutated.AmutantstrainA.niger()Keywordsmethylacrylicacid;acrylamide;inverse295withrelativelyhighyieldofcitricacidproducedfromemulsioncopolymerization;thickeningcornstarchwasobtained.Theconditionsconcerningcitricpropertyacidproductiononarotatoryshakerandina5LN.B.S.
Bioflo2?
fermentorwerestudied.Productivityofthecitric
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