在实验性注射黄杆菌冷菌后三种鲑的病理学和免疫组织化学.docx

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在实验性注射黄杆菌冷菌后三种鲑的病理学和免疫组织化学

在实验性注射黄杆菌冷菌后三种鲑的病理学和免疫组织化学

[摘要]为了评估黄杆菌的易感性在不同物种之间的差异,研究人员对虹鳟鱼，虹鳟（walbaum），海鳟，褐鳟，大西洋鲑，进行了实验。

此外，还对病理变化和内脏器官中的细菌分布的差异进行了研究。

在腹腔注射两个不同剂量：

高剂量（HD）1107菌落形成单位（CFU）鱼）和低剂量（LD）1106CFU鱼）1细菌。

LD组的死亡率介于0和7.5％之间，HD组在55-70％之间不等。

记录的死亡率在同种物种之间没有太大的区别。

按照虹鳟鱼鱼苗综合征的临床症状和病理反应，三种物种在这两点上是很相似的。

虹鳟鱼与其他物种相比，其脾脏的病变更明显。

肾小管上皮细胞及造血组织坏死最突出的是虹鳟和大西洋鲑。

在虹鳟和鳟鱼的肾小管上皮细胞内滴嗜酸性粒细胞两者很幸存的没有被感染。

用免疫组化研究发现分布在内脏器官的细菌存在三种相似。

关键词：

病理学，免疫组织化学，大西洋鲑鱼，黄杆菌，虹鳟鱼，海鳟鱼，易感性

引言

细菌性疾病（BCWD）和虹鳟鱼鱼苗综合征（RTFS）病，在世界许多地区的水产养殖地都有发生（Holt1987;Bernardet,Baudin-Laurencin&Tixerant1988;Wakabayashi,Horiuchi,Bunya&Hoshiai1991;Bustos,Calbuyahue,Montan˜,Opazo,Entrala&Solervicens1995）.。

病因论理论是在1948年从美国少年乔霍（Walbaum）溃疡的皮肤上提取出来的（Borg1960）。

黄杆菌冷菌的感染开始似乎只限制在北美。

直到上世纪80年代，黄杆菌冷菌的分离来自于德国的一次BCWD暴乱。

（Weis1987年）。

当时根据欧洲几个报告所述，在虹鳟鱼（Walbaum）身上发现了一种由黄杆菌冷菌造成的败血性疾病RTFS（Bernardet等人1988；洛伦岑达尔斯高，从奥勒·汉森，Hølyck，科斯岛，Mellergaard科技森1991；布鲁诺·1992年；托兰索科技巴尔哈1993年）。

受影响的虹鳟鱼鱼苗的临床症状包括厌食症、抑郁症和皮肤黑色素沉积症。

（洛伦岑等人1991年；布鲁诺1992年）。

在尸检中病变的鳃、肝、肾、脾肿大和肛门出血是最典型的特征（洛伦岑等人1991年；布鲁诺1992年）。

鱼苗和受BCWD影响的生物会经常有皮肤和肌肉病变以及前背肛门附近及下颚的病变（霍尔特1987年）。

RTFS与BCWD对鱼苗产生的外部病变似乎不太常见。

黄杆菌可能会影响所有的鲑鱼物种。

银大麻哈鱼被视为对黄杆菌特别敏感物种（霍尔特，Rohovec1993年）。

另外一些经常被影响的种类是红鳟鱼（洛伦岑等，1991年）和香鱼（Temminck&Schlegel），（Wakabayashi,Toyama&Iida1994）。

据报道鲑鱼的钩吻（Walbaum）是不容易受其影响的（Rucker,Earp&Ordal1953;Wood&Yasutake1956）。

黄杆菌也被ISO相关病定性为非鲑鱼物种，安圭拉（L.），即鳗鱼，鲫鱼，鲤鱼升，异育银鲫，欧洲鲤（L.），家鱼（L.）（Lehmann,Mock,Stu¨renberg&Bernardet1991））和苍白的鲢鱼，宽鳍鱲（Temminck&Schlegel），（IIDA＆mizokami1996年）。

虽然针对黄杆菌冷菌感染的研究已经了很多年了，但通过不同种类之间的比较却没有给出确定的结论。

由于海鳟，虹鳟，褐鳟，大西洋鲑，大西洋鲑的感染和病理上的差异，这项研究的目的在于评估任何易感性的物种差异。

材料和方法

实验用鱼

野生大西洋鲑鱼和鳟鱼从河达拉原产地运来，并在瑞典的商业养鱼场养殖虹鳟鱼卵，然后被运送到瑞典农业大学和乌普萨拉大学的病理系。

在孵化前10分钟（埃文斯vanodine国际PLC，普雷斯顿，英国）将鸡蛋放在1％的消毒液中进行消毒。

刚发育出的鱼苗被放在温度为10土0.5℃并具备良好通气环境的5L水族馆中。

卵黄囊被完全吸收后，开始对鱼苗使用商业鱼类所用的食物喂食，每日3次。

实验感染

一株从患肾脏病的大西洋三文鱼身上分离出的黄杆菌冷菌（1F-97），被用于所有的感染实验中。

把该菌株存储在－70摄氏度的蛋白胨和酵母膏盐（TYES）肉汤中（Holt等人，1993年）并增加了15％的甘油。

将这批次冷冻的细菌接种于肉汤并将其放在15℃的摇床上进行48小时培养。

细菌在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行两次为期为10分钟，温度在5℃，重悬于PBS中，在1500ｇ的条件下收取。

浊度测量分光光度计（ShimadzuUV-1601PC;ShimadzuScientifiInstrumentsInc.,Columbia,MD,USA）为525nm和调整，以吸光度与PBS0.4，相应的浓度大约2×108菌落形成单位（CFU）ｍｌ－1。

串行稀释和三联体接种在TYES琼脂（伴有１.１％琼脂的TYES肉汤）进行悬浮液中活菌数量的估计。

红鳟鱼的鱼苗（平均重量0.74±0.2g），大量的鲑鱼（平均重量0.70？

0.1g）和大西洋的鲑鱼（平均重量0.76±0.1g）被分别分配给五组，每个组有40条鱼。

在用浓度为10mgL的碳酸盐缓冲液MS222麻醉后（SandozLtd，Basel，瑞士），在每条鱼腹膜内（i.p.）注射0.05mL的细菌悬液。

在注射了1×106CFU鱼－１两个地计量组（ｌｄ）和注射了1×106CFU的鱼－1两个高剂量组（Hd）重复操作该免疫性试验。

一个高剂量组的两条海鳟在注射后的两天死亡，把这两条鱼排除在该研究之外。

每个注射了PBS的鱼种类中的每一组作为对照组。

死亡率和大体病理

每天至少记录疾病的死亡率和临床症状3到6次。

死亡的和濒死的鱼被检查作为大体病理的研究结果并把它们作为细菌学和形态学研究的样本。

作为细菌学研究样本的鱼一般不会用于形态学研究。

当所有剩下的鱼被MS222麻醉、采样用于细菌和形态学研究之前被杀死的21天，该实验宣告结束。

细菌学

用塑料循环把细菌样品从肾脏中取出，并把它放在TYES琼脂和5％马血琼脂上。

TYES琼脂在15℃下培养10天，血琼脂在20℃下培养7天。

为了得到表型特征，TYES琼脂上的黄色的菌落被进一步培养，来确保黄杆菌冷菌可以从病鱼身上再次分离出来。

表型特征适用于所有从感染的鱼分离出来的细菌，48h后的菌落和细菌型态，过氧化氢酶（30%H2O2），和细胞色素氧化酶的生产（Bactidrop氧化酶，Remel，美国），柱状曲桡型色素（20%KOH）,在6℃和30℃的TYES琼脂肉汤上生长，并在APIZYM渠道反应。

组织病理学

组织病理学的研究标本被固定在10％福尔马林磷酸缓冲（pH值7.2-7.4）。

鉴于有引起验尸报告的变化的可能，晚间死亡的鱼被排除在组织病理学研究之外。

把鱼苗的头和身体分开并分别用石蜡包裹，放入切片，并用苏木精和曙红染色（H&E）。

为了评估在肝脏中糖原的存在，我们用了碘酸-Schiff（PAS）染色。

组织病理学研究是在编码的载片上进行的。

病变，包括脾脏堵塞和出血，扩张的肾脏血窦和肾小管周围毛细血管扩张，肾脾坏死被记录为：

0=无病变，1=弱发展的病变，2=中度发展的病变，3=严重发展的病变。

每一组的病变分类均记录为平均值和标准差。

重复操作的视为一组。

对肾小管上皮细胞的细胞内嗜酸性液滴的存在进行形态计量研究。

重复操作的视为一组，Hd组被分为死亡鱼或濒死的鱼（Hd感病）和直到实验最后仍存活的鱼（Hd存活鱼）。

由于的Ld病群体的个人的较少数量，只有存活到实验最后（Ld存活鱼）的Ld组中的鱼被包括在研究。

从每组中随即取出10条鱼，随机计数100个肾小管×25倍率，并记录肾小管细胞内的嗜酸性粒细胞包裹体。

记录每一组的平均值和标准偏差。

免疫组织化学

从石蜡包埋组织切出2-3u吗m,安装在SuperFrost®Plus玻璃上进行免疫组化染色（门泽尔，德国）。

根据制造商的说明，使用到了卵白素一生物素免疫组化试剂盒，vectastain®精英ABC试剂盒（媒介实验室有限公司，伯林盖姆，加利福尼亚，美国）。

3%过氧化氢对内源性过氧化物酶的活性淬火5分钟。

用到了一个多克隆抗体，在抗兔黄杆菌冷菌，抗-Th（埃文森和洛伦岑-1996年），在0.05米的缓冲液中按1:

5000稀释，PH值为7.6。

用阴性对照组的TRIS或非免疫兔血清替换该抗体。

作为色原，3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）被用来作为染液Mayer的苏木精。

在编码的载片上进行评估。

统计学

Fisher精确测试被用来评估不同物种的死亡率和大体病理发现。

为了评价不同物种的病理结果和存肾小管细胞质内嗜酸性液滴的存在，就进行了Mann–WhitenyU测试。

结果

死亡率和大体病理

对照组没有发现细菌。

LD或HD组的物种之间的死亡率没有显着差异。

海鳟LD组无死亡记录。

在注射后的6天Ld组的一条虹鳟鱼死亡。

大西洋鳟两个Ld组的死亡率为7.5%，在每个重复组，注射后的2-7天，有三条鱼死掉。

在Hd组，死亡率介于55%-70%（图1），海鳟重复组的平均死亡率是56.4%，虹鳟鱼重复组的事56.2%，大西洋鳟是68.8%。

在注射后的第一到三天内记录了最高死亡率，在十天后就无死亡记录了（图1）。

图1用黄杆菌和嗜冷杆菌实验性感染后，高剂量组和对照对的累积死亡率（a和b是重复组）

在对照组无患病的临床症状。

Hd组合Ld组的三种患病鱼的临床症状相似，都是神经性厌食症，皮肤黑色素沉积和鱼漂浮在水表面或躺在水箱底部。

实验的最后，在Hd组或是Ld组存活的鱼和对照组的鱼都没观察到有大体病理。

在Hd组死亡的鱼和濒死的鱼身上的主要的大体病理就是鱼鳃苍白，皮肤黑色素沉积，脾脏肿大，肝脏和肾脏苍白，和肠道为空。

常常有肛门出血，常伴有水肿，并在某些情况下，肛门附近的皮肤溃疡，尤其是海鳟。

所有物种的注射部位出血都有出现，打包在大西洋鳟身上更为常见。

细菌学

在注射后的21天实验结束后，无论是在Ld组或是Hd组的鱼或是对照组的鱼的肾脏中都没有培养嗜冷杆菌或是其他任何致病细菌。

只有表性特征与嗜冷杆菌1F-97相同的黄色素细菌被从样本死亡鱼或是濒死鱼的肾脏中被再次分离出了。

组织病理学

在对照组或是存活到实验最后的高剂量组的鱼没有组织病理发现被记录。

高剂量组已死或是濒死的鱼的组织病理发现是相似的。

表1总结了高剂量组已死和濒死鱼的肾脏和脾脏的平均变化分数。

脾脏的变化包括充血，水肿和坏死（图2）。

这些发现在和虹鳟鱼身上变现更为明显。

在这些物种中，有时会出现大量出血并伴随器官正常结构的彻底销毁。

表1从腹腔内注射黄杆菌冷菌的高剂量组的死亡或是濒死的鱼的脾脏和肾脏的病理变化（叫做ＳＤ）

*其他两个物种的显著不同（ｐ＜０.０５）

变化被记录为：

0=无病变，1=弱发展的病变，2=中度发展的病变，3=严重发展的病变

虹鳟鱼和海鳟的一个突出发现是肾脏的肾小管上皮细胞的胞浆内嗜酸性粒细胞液滴（图４）。

与对照组相比，存活的虹鳟鱼的Ｈｄ组和Ｌｄ组的鱼，还有海鳟的Ｈｄ组存活或是感病的鱼的肾小管胞浆内嗜酸性粒细胞液滴的数量显着较高（图６）。

在对照组和Ｈｄ组合和Ｌｄ组中存活的鱼中，含有大量糖原的肝细胞用阳性ＰＡＳ染色表示。

在死鱼中，得到了所有这三个物种的Ｈｄ组合Ｌｄ组没有ＰＡＳ染色呈阳性的死鱼。

这三个物种偶尔出现肝细胞的单个细胞坏死。

在肠道内的尾鳍部分经常观察到臀鳍部位的充血病变。

在肛门附近的表皮增生，泡沫化，表皮空泡化和细胞坏死是经常存在。

此外，在该地区也观察到皮下组织和肌肉坏死和出血，在真皮和皮下组织常常伴有大量的丝状细菌，有时会有轻微的粒细胞浸润。

肌肉和皮下组织的注射部位的出血和坏死是经常存在的，尤其是大西洋鲑鱼（图5）。

有时还伴有轻微的粒细胞浸润病变。

在某些情况下，与基底表皮细胞表皮增生伴空泡化也会出现。

免疫组化

在对照组的所有鱼类中都没有发现免疫组化染色阳性的组织材料。

从高剂量组和低剂量组中得到的已经死亡或垂死的鱼表现出了相似的细菌分布。

在三种鱼类的内部器官中黄杆菌螺菌的分布没有太大的不同。

在腹腔中存在自由细菌和染色阳性的巨噬细胞，有时包括腹膜和肠系膜脂肪中的肠道浆膜。

在鳔和肾脏周围松散的结缔组织中看到大量的细菌和染色阳性的巨噬细胞而且自由细菌常在通常所述的腰椎（图7a）。

在脾脏内，大量的自由细菌往往在存在于薄壁组织内，尤其是在虹鳟鱼体内。

染色阳性的巨噬细胞包括最著名的在海鳟鱼和大西洋鲑鱼体内的黑色素巨噬细胞（图7B）。

在肾脏，染色阳性的巨噬细胞和自由细菌在血管系统中被发现。

染色阳性的内皮细胞的粘附巨噬细胞以及观察血管内皮细胞也都被发现为染色阳性（图7C）。

在造血组织内，染色阳性的巨噬细胞和黑色素巨噬细胞同样被发现（图7D）。

染色阳性的肾小球在许多鱼类中也是有记录的（图7D）。

在肝脏中，阳性染色的巨噬细胞和自由细菌在血管和血窦的内皮细胞中也存在着（图7E）。

一些阳性染色细胞间质，可能是巨噬细胞，也在心脏和脑室和心内膜摄入的细菌所在的血管内皮细胞中被观察到（图7f）。

大多数的鱼，在臀鳍区域都能看到许多自由细菌及吞食细菌的巨噬细胞，包括小肠和真皮，皮下组织和肌肉。

大量的细菌覆盖了臀鳍的软骨。

此外，染色阳性的自由细菌和吞食细菌的巨噬细胞目前存在于多个器官的血管系统中，包括鳃，肠，脑，脊髓和眼睛的脉络膜。

那些从高剂量组中幸存的鱼类，一直到实验结束都能在脾脏和皮下组织看到阳性染色的巨噬细胞，其中一些在肛门区域。

从低剂量组中幸存的鱼类，一直到实验结束都没能看到有阳性染色细胞出现。

图2-5是感染黄杆菌螺菌后的鱼苗组织切片，高剂量组（H&E）.。

图2是垂死的虹鳟鱼的脾切片，充血和坏死的灶性领域（箭头）（柱形=0.05毫米）。

图3垂死的大西洋鲑鱼的肾脏。

扩张的肾小管周围毛细血管（*）和坏死的肾小管上皮细胞（箭头）（柱形=0.05毫米）。

图4幸存的虹鳟鱼肾脏。

肾小管上皮细胞（箭头）嗜酸性粒细胞胞浆液滴（柱形=0.05毫米）。

图5大西洋鲑鱼的注射部位。

出血（箭头）和坏死的肌肉纤维（*）（柱形=0.1毫米）。

图6对照组中肾小管（平均的SD）嗜酸性粒细胞胞浆内液滴，在低剂量（Ld）组（1·106菌落形成单位（CFU）1）中幸存的鱼苗和在高剂量（Hd）组（1·107菌落形成单位（CFU）1）中幸存和发病的鱼苗的百分比，感染试验后黄杆菌含量和对照组明显不同。

讨论

在本研究中，三个品种在腹腔注射黄杆菌螺菌导致败血性感染的免疫实验中，表现出的死亡率无明显差异。

根据患有RTFS的虹鳟鱼鱼苗描述得出的病鱼临床症状，总量和组织病理学的逻辑结果（Lorenzenetal.1991;Bruno1992;Rangdale,Richards&Alderman1999）。

在脾脏的病理变化方面，虹鳟鱼比在其他两个物种出现了更广泛的坏死，出血和更多的自由细菌。

类似的病理结果已经在虹鳟鱼鱼苗的自然感染中作为RTFS的病征描述过了（Lorenzen1994;Rangdaleetal.1999）。

与海鳟相比，虹鳟和大西洋鲑鱼在肾脏肾小管上皮细胞和造血组织病变坏死方面表现得更为明显。

肾脏的退行性变化包括坏死，已在银大麻哈鱼（Wood&Yasutake1956）和虹鳟鱼（Bruno1992;Evensen&Lorenzen1996）.的黄杆菌螺菌感染的联系中作出阐释。

经常可以看到在看起来健康的鱼肾脏的肾小管上皮细胞中嗜酸性粒细胞胞浆内的泡沫和高氨氮水平的毒物（弗格森1989）接触（Ferguson1989）。

在这项研究中，对照组和受感染的虹鱼和海鳟鱼群体之间存在一些明显的差异。

肾脏的肾小管上皮细胞的嗜酸性粒细胞水滴的存在已在虹鳟鱼的黄杆菌螺菌的自然感染和实验中被证实（Lorenzenetal.1991;Lorenzen1994）。

这种病变可能是因为在肾小球蛋白质的泄漏以及随后在肾小管上皮细胞的蛋白质摄或在吸收蛋白质的透明变性的肾小管上皮细胞的细胞干扰。

在三种病鱼的肝细胞中均发现有糖原耗尽的现象。

这可能是由于细菌内毒素的扩散引起的。

内毒素诱导的肝细胞糖原耗竭，已在银大麻哈鱼原代肝细胞接触到大肠杆菌和鲑气单胞内（Wedemeyer,Ross&Smith1969）中被证明，这是由糖原磷酸在体外加速活化来解释的。

厌食也可能导致糖原耗竭。

虹鳟鱼在饥饿（Vijayan&Moon1992）状态下肝脏中糖原水平降低已在实验中被证实。

然而，疾病的临床症状和从发病到死亡这段时间内迅速恶化的现象，使得这种假设的可能性较小。

对脊椎变形的慢性黄杆菌螺菌的感染（Holtetal.1993;Madsen&Dalsgaard1999a;Madsen,Arnbjerg&Dalsgaard2001）和慢性骨膜炎，骨炎及头剥脱性骨软骨之间共同对骨骼的影响已经做出了描述（Kent,Groff,Morrison,Yasutake&Holt1989;Ostland,McGrogan&Ferguson1997）。

在这项研究中，众多的免疫组化染色阳性细菌被视为臀鳍的椎骨和软骨的概述。

这种软骨和不成熟的骨亲和力，黄杆菌螺菌分泌的II型胶原酶可以与软骨和不成熟的骨骼结合，使细菌定植并侵入到这些组织中（Ostland,Byrne,Hoover&Ferguson2000）。

在注射部位的病变是一个共同的发现，尤其是在大西洋鲑鱼。

这强调了在感染实验中使用传统的注射技术来实现免疫性试验方法的难度。

这可能与使用细菌悬浮浸泡或共处感染有关，在（Holt1987;Lorenzen1994;Decostere,Lammens&Haesebrouck2000）.的报告中的重复性结果还存在问题。

然而，在人工皮肤伤口，粘液擦伤或应激接触一起浸泡方面的的免疫性试验已经取得了成功（Madsen&Dalsgaard1999b;Garcia,Pozet&Michel2000;Madetoja,Nyman&Wiklund2000）.。

图7显示了免疫组化染色，多克隆黄杆菌黄杆菌螺菌抗体的ABC-方法，AEC作为显色，迈尔氏苏木精明矾的反染色染剂。

死/垂死的鱼在高剂量组。

（a）大量的细菌，概述了椎骨（箭头）（鳟鱼）（栏中¼0.05毫米）。

（b）染色阳性的巨噬细胞（箭头）和自由的细菌（箭头指向）在脾的薄壁组织（鳟鱼）（栏中¼0.05毫米）。

（c）染色阳性的内皮细胞（箭头）和巨噬细胞在肾脏肾小管周围毛细血管（虹鳟鱼）（箭头）（栏中=0.01毫米）。

（d）染色阳性的肾小球和巨噬细胞在肾脏（大西洋鲑）的造血组织（箭头）（栏中¼0.05毫米）。

（e）染色阳性的内皮细胞（箭头）和巨噬细胞（箭头）在肝脏毛细管（虹鳟鱼）（栏中¼0.05毫米）。

（f）染色阳性的内皮细胞（箭头）和在心脏的心房（大西洋鲑）（栏中¼0.05毫米）循环中的吞噬细胞（箭头指向）。

总之，在这项研究中记录虹鳟鱼，海鳟鱼和大西洋鲑对黄杆菌螺菌感染的易感性没有太大的差别。

尽管在当前的病理表现上有些差异，但三种鱼还是生出一种相同的，类似于RTFS的败血性疾病，而且细菌在内脏器官中也有着相似的分布。

致谢

感谢EllenLorenzen博士,Århus,Denmark提供的抗体。

感谢ÅsaGessbo和ChristinaNilsson高超的的筹备组织切片和免疫组化染色能力。

该项研究是由瑞典农林研究（SJFR）理事会的支持下进行的。

参考文献

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