细菌形态理化鉴定分解.docx
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细菌形态理化鉴定分解
细菌形态理化鉴定
1形态学特征2
2生理生化特性实验2
1、尿素酶(Urease)试验2
2、氧化酶(Oxidase)试验3
3、过氧化氢酶的测定3
4、甲基红(MethylRed)试验4
5、V-P试验4
6、含碳/氮化合物的利用4
7、葡萄糖的氧化发酵试验(O-F实验)5
8、糖或醇类发酵试验6
9、硝酸盐(Nitrate)还原试验7
10、靛基质(Imdole)试验(吲哚试验)7
11、三糖铁(TSI)琼脂试验8
12、氨基酸脱羧酶的测定8
13、硫化氢(H2S)试验8
14、柠檬酸盐或丙酸盐的利用9
15、利用丙二酸盐试验9
16、葡萄糖酸盐的氧化9
18、β-半乳糖苷酶(ONPG)的测定10
19、耐盐性试验10
20、卵磷脂酶的测定10
21、石蕊牛奶的反应11
22、酪素水解试验(酪蛋白水解)11
23、酪氨酸水解12
24、苯丙氨酸脱氨试验12
25、产糊精结晶试验12
26、从甘油产生二羟基丙酮12
27、厌氧硝酸盐产气12
28、马尿酸盐水解试验13
29、对叠氮化钠的抗性13
30、氰化钾试验13
31、对溶菌酶抗性的测定13
32、在pH5.7营养肉汤上的生长13
33、需氧性试样14
34、明胶(Gelatin)液化试验14
35、淀粉水解试验14
36、生长温度的测定15
37、形成芽孢的培养基15
38、O/129的敏感性试验15
1形态学特征
1.1菌落形态
培养到24h后观察平板上单菌落形状、大小、颜色与突起特征。
1.2细胞形态
光学显微镜观察菌体的形态、大小、运动性等。
1.3革兰氏染色
取无油迹的干净载玻片,滴上一滴无菌蒸馏水,用接种环挑取少许菌苔,于水滴边缘轻轻涂几下。
自然风干,在火焰上通过几次,固定涂片。
滴加结晶紫液,染1min,用水冲净结晶紫液。
滴加碘液冲净残水,并覆盖约lmin。
用水冲去碘液,将片上的水甩干。
滴加95%乙醇液脱色约20-30s,并立即用水冲净乙醇。
用番红液染l-2min。
用水洗净番红,风干,用显微镜油镜观察涂片。
1.4芽孢染色
取培养24h左右的菌体涂片、干燥、固定。
滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿使沸腾,切忌使染液蒸干,必要时可添加少许染液。
加热时间从冒蒸汽时开始计时约4-5min。
倾去染液,待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
用蕃红水溶液复染lmin,水洗。
待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色。
1.5荚膜染色
按常规取菌涂片,空气中自然干燥。
用1%的结晶紫水溶液染色2min。
以20%的硫酸铜水溶液冲洗,用吸水纸吸干残液。
干后用油镜观察。
菌体染成深紫色,菌体周围的荚膜呈淡紫色。
2生理生化特性实验
1、尿素酶(Urease)试验
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。
尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。
其活性最适pH为7.0。
试验方法:
挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。
或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。
培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。
培养基配制方法:
蛋白胨:
1g;NaCl:
5g;KH2PO4:
2g;葡萄糖1g;琼脂:
15g;酚红:
0.012g;蒸馏水1000ml。
除酚红外,溶解上述成分,并调节PH为6.8~6.9,然后加入酚红指示剂,使培养基呈橙黄色,分装,115℃灭菌20min。
待培养基冷至50℃左右,加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液,使其终浓度为2%。
试验方法:
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,培养1~4d观察结果,如为阴性应继续培养一下,作最终判定,变为粉红色为阳性。
2、氧化酶(Oxidase)试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。
试验方法:
在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewing氏改进试剂呈蓝色。
阴性者无颜色改变。
应在数分钟内判定试验结果。
注意事项:
(1)盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化,溶液应装在棕色瓶中,并在冰箱内保存,如溶液变为红褐色,即不宜使用。
(2)铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应,若用它来挑取菌苔,会出现假阳性,故必须用白金丝或玻璃棒(或牙签)来挑取菌苔。
(3)在滤纸上滴加试剂,以刚刚打湿滤纸为宜,如滤纸过湿,会防碍空气与菌苔接触,从而延长了反应时间,造成假阴性。
3、过氧化氢酶的测定
过氧化氢酶又称接触酶,能催化过氧化氢分解水和氧。
1.试剂:
3-10%过氧化氢(H2O2)
2.菌种培养:
将测试菌种接种于合适的培养基斜面上,适温培养18-24h。
3.试验方法:
取一干净的载波片,在上面滴1滴3-10%的H2O2,挑取1环培养18-24h的菌苔,在H2O2溶液中涂抹,若有气泡(氧气)出现,则为过氧化氢酶阳性,无气泡者为阴性。
也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上,观察气泡的产生。
4.注意事项:
过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶,所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。
4、甲基红(MethylRed)试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。
挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于36±1°C或30°C(以30°C较好)3~5天,从第二天起,每日取培养液1ml,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂,pH范围为4.4~6.0,其pK值为5.0。
故在pH5.0以下,随酸度而增强红色,在pH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。
5、V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。
通用培养基配制方法:
蛋白胨5g;葡萄糖5g;NaCl/(K2PO4-一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定):
5g;蒸馏水:
1000mL;PH:
7.0~7.2,分装试管,毎管装约4~5cm,115℃灭菌20min。
试剂:
40%NaOH(或KOH),6%a-萘酚。
试验方法:
将试验菌接种于上述培养基,于36±1°C培养4天培养48-96小时,培养液2ml先加入1mla-萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液,再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±1°C恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性.
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。
6、含碳/氮化合物的利用
细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源,反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系,因而作为鉴定依据。
测定的基础培养基配方很多,因种而异。
现介绍1种合成的基础培养基,有些细菌还可适当补加各种维生素。
培养基可制成液体,分装试管,也可制成固体平板。
可用于测定的底物种类很多,有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。
糖的含量一般为1%,醇类酚类等的含量一般为0.1-0.2%,氨基酸的含量一般为0.5%。
因碳氢化合物不溶于水,可在液体培养基中振荡培养,或加入到45℃的固体培养基中,振荡后立即倒成平板。
有些底物不宜用高压灭菌,可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基础培养基中,某些醇类和酚类不必灭菌。
接种和观察结果:
菌种最好做成悬液,避免带入少量碳源干扰试验结果。
平板培养用接种环点种,液体培养则用直针接种。
每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。
适温培养2、5、7天后观察,凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况,明显超过空白培养基的生长量为阳性,否则为阴性。
假若两种培养基上生长情况差别不明显,开在同一培养基上连续移种3次,如差别仍不明显则以阴性论。
(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。
)
(1)菌株对碳源的利用
Mandel盐营养液[54]:
NaNO32.0g/L,K2HPO41.5g/L,CaCl21.5g/L,MgSO40.3g/L,
FeSO4·7H2O5.0mg/L,MnSO4·H2O1.6mg/L,ZnSO4·H2O1.4mg/L,CoCl20.5mg/L.Mandel盐营养液+2%琼脂+2%碳源。
碳源分别为:
葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、
蛋白胨水培养基1000mL
糖发酵培养基:
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL,另配20%糖溶液10mL
调节pH7.6,115℃灭菌30min,备用。
木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。
每支试管内装10
mL培养基,制成斜面培养基,无菌下接种,每种碳源接种二管,一支不接种做对照,31℃
培养。
连续3代移种,生长者为阳性。
(2)菌株对氮源的利用
无氮的Mandel盐营养液+2%琼脂上铺无菌滤纸+1%不同的氮源。
氮源分别为:
NH4+、NO3-、蛋白胨、酵母膏、尿素,每种氮源制三个斜面,其中一个做对照,无菌条
件下接种,31℃培养4d,观察结果。
7、葡萄糖的氧化发酵试验(O-F实验)
在细菌鉴定中,糖类发酵产酸是1项重要依据。
细菌对糖类的利用有2种类型:
1种是从糖类发酵产酸,不需要以分子氧作为最终受氢体,称发酵型产酸;另一种则以分子氧作为最终受氢体,称氧化型产酸。
前者包括的菌种类型为多数。
氧化型产酸量较少,所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和,而不表现产酸。
为此,Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基,用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。
这一试验广泛用于细菌鉴定。
一般用葡萄糖作为糖类代表。
也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。
(1)接种:
以18-24h的幼龄菌种,穿刺接种在上述培养基中,每株菌接4管,其中2管用油封盖(凡士林:
液体石蜡=1:
1混合后灭菌),约加0.5-1厘米厚,以隔绝空气为闭管。
另2管不封油为开管,同时还要有不接种的闭管作对照。
适温培养1、2、4、7天观察结果。
(2)结果观察:
氧化型产酸――仅开管产酸,氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱(1-2d),后来才稍变酸。
发酵型产酸则开管及闭管均产酸,如产气,则在琼脂柱内产生气泡。
8、糖或醇类发酵试验
原理:
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
有些细菌分解某些糖(醇、苷)产酸(符号:
+)、产气(符号:
○),培养基由紫(蓝)变黄(指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果),并有气泡;有些产酸,仅培养基变黄;有些不分解糖类(符号:
-),培养基仍为紫(蓝)色。
培养基配制:
一般细菌常用休和李夫森二氏培养基:
蛋白胨:
2g,K2HPO4:
0.2g,NaCl:
5g,糖(醇、糖苷):
1%,水洗琼脂:
5~6g,蒸馏水:
1000mL,PH:
6.8~7.0,溴百里酚蓝:
1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后,再加水配成1%水溶液)。
先调PH后再加指示剂。
芽孢杆菌培养基配制:
(NH4)2HPO4:
1g,MgSO4:
0.2g,KCl:
0.2g,酵母膏:
0.2g,糖(醇、糖苷):
1%水洗琼脂:
5~6g,蒸馏水:
1000mL,溴甲酚紫:
0.4%乙醇液2mL,PH:
6.8~7.0。
先调PH后再加指示剂。
将以上培养基分装试管,培养基高度约为4~5cm,115℃灭菌20min。
测定的糖(醇、糖苷)类可以包括:
葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖(1.5%)、半乳糖(1.5%)、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。
注意:
以上亦可用液体培养基。
接种和观察结果:
用18~24h的幼龄菌种,用穿刺针接种于培养基中,适温培养1d,3d,5d后观察,颜色变黄为阳性,不变为阴性;有气泡产生为产气。
结果记录:
产酸:
+,产气:
○,不产酸长气:
-。
法2
试验方法:
以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。
接种后,置36±1.0°C培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和An-drade指示剂。
注:
对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在36℃18-24h即可出结果。
9、硝酸盐(Nitrate)还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法:
临试前将试剂的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。
进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。
α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
硝酸盐还原试验培养基:
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl5g、KNO31g、蒸馏水1000mL
调节pH7.2-7.4,121℃灭菌20min,备用。
10、靛基质(Imdole)试验(吲哚试验)
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。
试验方法:
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或乙醚等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。
吲哚试验培养基:
蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000mL调节pH7.6,121℃灭菌20min,备用
法2:
试剂:
对二甲氨苯甲醛1g、95%乙醇95ml、浓盐酸20ml。
配置时,应先用乙醇溶液溶解对二甲氨苯甲醛,再缓慢加入盐酸即成。
此试剂不能久存,宜少量配制,并避光保存于冰箱中或阴凉处。
试验方法及结果:
将细菌纯培养物接种到蛋白胨水培养基中,37℃培养24-72h后,沿管壁缓慢加入2-3ml的试剂于培养物的液面上。
在两层液体交界面出现红色环者为阳性,阴性反映者不变色。
为了使颜色明显,在加入试剂之前,先向培养物种加入1ml乙醚,并充分振荡,使靛基质溶于乙醚中。
静置片刻,使乙醚层浮于培养物的液面。
此时,再按上述方法徐徐加入试剂5-10滴,并观察判定结果。
11、三糖铁(TSI)琼脂试验
试验方法:
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±1℃培养18~24h,观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。
葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。
12、氨基酸脱羧酶的测定
有些细菌含有氨基酸脱羧酶,使羧基释出,生成胺类和二氧化碳。
此反应在偏酸的条件下进行。
当培养基含胺类时呈碱性反应,使指示剂变色。
接种与观察结果:
用幼龄培养液作为菌种,直接接种。
接种后封油,对照管与测定管同时接种封油。
肠肝菌科的细菌于37℃培养4天观察。
当指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性,呈黄色者为阴性。
对照管应呈黄色反应。
13、硫化氢(H2S)试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法:
在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。
阴性应继续培养至6天。
也可用醋酸铅纸条法:
将待试菌接种于一般营养肉汤,再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空,以不会被溅湿为适度;用管塞压住置36±1℃培养1~6天。
纸条变黑为阳性。
硫化氢试验培养基
pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL
硫代硫酸钠0.25g
10%醋酸铅水溶液1mL
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL加热溶解,待冷至60℃时加入硫代硫酸钠
0.25g,调至pH7.2,,装入三角瓶中,115℃灭菌15min,取出后待冷至55-60℃,加入10%醋酸铅水溶液(无菌的)1mL,混匀即可。
14、柠檬酸盐或丙酸盐的利用
某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源,及磷酸胺作为氮源,将柠檬酸分解为二氧化碳,则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。
接种与观察结果:
取幼龄菌种接种于斜面上,适温培养3-7天,培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应,不变者则为阴性。
培养基:
硫酸镁0.2g磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g枸橼酸钠5.0g
氯化钠5.0g琼脂15.0g
1%溴麝香草酚蓝酒精溶液8.0ml
蒸馏水990ml
制法:
将各物(除溴麝香草酚蓝溶液外)混合于蒸馏水内,加热溶解,校正pH7.0,再加入溴麝香草酚蓝液,混匀后分装试管,121℃20min高压灭菌后摆成斜面。
培养基呈淡绿色。
培养基摆成斜面。
将培养物划线接种。
在最佳生长温度培养7d。
结果记录:
微生物利用柠檬酸何在柠檬酸琼脂上的生长导致了碱性反应,因此培养基中的溴百里芬兰指示剂由绿色变为亮蓝色;如果微生物没有利用柠檬酸且在柠檬酸琼脂上没有生长,则培养基的颜色不发生变化。
15、利用丙二酸盐试验
丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。
能否利用丙二酸盐,也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。
许多微生物代谢有三羧酸循环,而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,与丙二酸不被分解,所以琥珀酸脱氢酶被占据,不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应,抑制了三羧酸循环。
接种和观察结果:
用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基,于适温培养1-2d,观察培养基变色情况。
如测定培养基生长并变蓝色,表示可利用丙二酸盐,为阳性结果。
反之,如测定培养基未变色,而空白对照培养基生长,则为阴性,即不利用丙二酸盐。
16、葡萄糖酸盐的氧化
假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌,可氧化葡萄糖酸为2-酮基葡萄糖酸。
葡萄糖酸无还原性基团,氧化后形成酮基,则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu2O沉淀。
试验方法:
用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1%葡萄糖酸盐(可用葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙)的溶液。
分装试管,每管2mL。
刮取适温培养18-24小时的菌苔至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制成浓的菌悬液,置30℃过夜,然后每管加入0.5mL的斐林试剂,放在沸水浴中加热10分钟,试管中液体由蓝色变为黄绿,绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应,如溶液不变色者为阴性。
17、硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验
试验方法:
以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培养18~24h,观察结果。
培养物呈现黑色为硫化氢阳性,混浊或沿穿刺线向外生长为有动力,然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。
培养基未接种的下部,可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选,与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。
18、β-半乳糖苷酶(ONPG)的测定
本试验应用于肠肝菌科的鉴定。
测定步骤:
(1)将测定菌接种于TSI斜面上,培养于37℃18h(或其他最适温度)
(2)挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液,每管加1滴甲苯,摇匀(有助于酶的释放),于37℃放置5分钟。
(3)在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/LONPG,测定管置于37℃水浴培养。
经30分、1、2、3、……24h进行观察,如有黄色者则为阳性。
19、耐盐性试验
本试验是观察渗透压对细菌生长的影响。
由于不同菌类耐盐性不同,故常以此作为鉴别特征。
一般可根据不同种类的菌株,选择其适合生长的培养基,在其中加入不同量的NaCl,接种后观察其生长与否,以判断其耐盐性。
以肉汤培养液根据鉴定需要,配成不同浓度的NaCl,如2%、3.5%、5%、7%、10%等。
培养基要求十分澄清,接种时应采用幼龄菌液,直针接种,适温培养3-7d,与未接种的对照管对比,目测生长情况。
20、卵磷脂酶的测定
菌体如存在有卵磷脂酶,就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱。
接种与观察结果:
将测试菌的菌液,环接在有卵黄的试管和不加卵黄的对照管中,适温培养1、3或5天观察。
假若与对照管相比较,在卵黄胰胨液中或表面,形成白色沉淀者,则为阳性反应,表示卵磷脂被分解,生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱,说明有卵磷酶的存在。
另一种方法:
以无菌操作取出卵黄,放入灭菌的三角瓶中,加相当于等量的生理盐水摇匀后,取10mL卵黄液加入到溶化的约50-55℃的200mL肉汁胨琼脂培养基中,混合均匀后倒入培养皿,制成卵黄平板,过夜后即可使用。
接种与观察结果:
将测试菌点接在卵黄平板上,每皿可分散点接4-5株菌、(芽孢杆菌以点接1-2株菌为宜)以不影响结果观察为度,如测试厌氧菌,则须在上面加盖无菌的盖玻片。
每株菌至少重复点接两皿。
适温培养1-2d观察,在菌落周围形成乳白色混浊环,表示卵磷脂被分解,生成脂肪,说明该菌株有卵磷脂酶存在。
21、石蕊牛奶的反应
牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白。
细菌对牛奶的作用有一下几种:
(1)产酸――细菌发酵乳糖产酸,使石蕊变红。
(2)产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质,使石蕊变蓝。
(3)胨化――细菌产生蛋白酶,使酪蛋白分解,故牛奶变得比较澄清。
(4)酸凝固――细菌发酵乳糖产酸,使石蕊变化,当酸度很高时,可使牛奶凝固。
(5)凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶,使牛奶中的酪蛋白凝固,此时石蕊常呈蓝色或不变色。
(6)还原――细菌生长旺盛,使培养基氧化还原电位降低,因此石蕊还原褪色
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