中药复方研究室细胞与分子实验操作指南.docx
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中药复方研究室细胞与分子实验操作指南
中药复方研究室细胞与分子实验操作指南
〔2021.9〕
第一章细胞实验操作
第1节细胞培养常用耗材与设备
1.准备室中常见耗材与设备
去离子水制备器、酸缸、烘箱、高压灭菌锅、储藏柜〔放置干净未消毒的物品〕。
容量瓶〔500ml,1L〕、锥形瓶〔500ml,1L〕、磁力搅拌器、pH计、电子精密天平、台式离心机、冷冻离心机、涡旋器、普通冰箱〔4℃,-20℃〕、超低温冰箱〔-70℃〕。
细胞培养瓶〔25mm2,75mm2,175mm2〕、细胞培养板〔96-well,24-well,12-well,6-well〕、细胞培养皿〔35mm,60mm〕、细胞冻存管〔2ml,5ml〕、离心管〔10ml〕、移液管〔2ml,5ml,10ml〕。
μl,10μl,100μl,200μl,1000μl,5ml〕,枪头〔10μl,200μl,1ml;颜色分别为:
白,黄,蓝〕,eppendorf管〔0.5ml、1.5ml〕。
2.细胞房中常见耗材与设备
超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、普通冰箱〔4℃,-20℃〕。
酒精喷壶〔装75%酒精〕,酒精棉〔浓度为75%〕、纯酒精〔>95%,酒精灯使用〕
第2节无菌操作
1.无菌室的清扫与灭菌
1)定期清扫无菌室:
先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰新洁尔灭擦拭。
2)培养箱定期灭菌:
用75%酒精擦拭孵箱内部〔最好同时将孵箱中各隔层拆下〕,再用紫外灯照射。
〔对于含有自动灭菌程序的孵箱,先用75%酒精擦拭后,再启动其灭菌程序〕
3)实验前细胞房与超净台的灭菌:
翻开紫外灯,照射30min左右。
4)每天实验结束后,应及时清理垃圾筒中垃圾。
2.实验人员的无菌准备
1)实验前应用肥皂洗手。
2)穿好实验服,更换拖鞋。
3)75%酒精消毒双手。
3.操作台中的无菌操作
1)在超净台经紫外照射灭菌后,实验人员应注意在通风条件下进行实验操作。
2)在通风条件下,先点燃酒精灯,再用酒精棉擦拭超净台桌面〔尽可能的大于自己所用台面〕,同时保持工作区域的宽敞。
3)实验人员应去除无菌区与有菌区的概念。
超净台虽经紫外照射除菌,但也是相对的,因此,操作时应靠近酒精灯火焰。
4)操作时应尽量减少手臂的运动,尽可能防止左右手交叉〔近手操作〕:
把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边,以酒精灯为界,左手用的东西放在酒精灯的左边,右手用的东西放在右边。
例如,一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体,那么移液枪应放在右手,而枪头与试剂瓶都应放在左手边。
5)带入操作台中的物品,应注意:
刚经高压灭菌的可以直接放入超净台中;临时带进来的,应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台,这类物品包括各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等。
6)要养成用镊子操作的习惯:
拿取饭盒中的各类物品,尽可能用镊子去夹取;对于小的物品,如瓶盖、枪头、eppendorf管,应防止用手直接去拿取。
7)翻开的瓶子,应放在酒精灯火焰旁,瓶盖反放朝上。
禁止在翻开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作〔包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西〕。
8)实验结束后,依次将个人物品带出超净台〔包括废液缸〕,用酒精棉擦拭桌面,熄灭酒精灯,最后调小风力并关掉日光灯。
9)废液的处理:
先将废液缸中的液体倒入下水道,再将废液缸中其他东西倒入垃圾篓中〔尽可能防止将大量废液倒入垃圾篓中〕。
4.其他考前须知
1)保持试剂瓶与桌面成约45℃时翻开盖子或移取液体:
这样可以尽量减少空气的污染以及在移液时产生最少的气溶胶。
2)在翻开试剂瓶、拿取瓶盖、镊子及玻璃移液管等时都要用火烧下:
灼烧不是为了灭菌,只需在火焰上燎1~3秒即可。
灼烧一下瓶口和移液管等,使颗粒固定在外表和制造一个向上的气流,以减少掉落颗粒的数量。
3)定期检查CO2钢瓶的压力。
4)定期检查孵箱中水盘中的水量及是否污染〔最好每周更换一次,用无菌水〕
第3节培养用品的清洗
1.玻璃器皿的清洗
1)自来水或肥皂水刷洗。
2)烘干,泡酸:
烤箱中烘干,浸入洗液〔重铬酸钾120g:
浓硫酸200ml:
蒸馏水1000ml,先将重铬酸钾溶于水中,待凉,将浓硫酸缓慢倒入其中,边倒边搅拌〕中,浸泡12小时,然后从酸缸里捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
3)烘干、包装:
洗干净后先烘干,然后用牛皮纸〔油光纸〕包装,待用。
2.橡胶与塑料制品的清洗
橡胶和制品通常处理方法是:
先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序。
1)针式滤器帽不能泡酸液:
用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟〔指新的滤器〕。
用过的滤器,每次用完后及时用自来水、蒸馏水、双蒸水冲洗干净,晾干就可。
2)新胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟〔用过的胶塞只要用沸水处理30分钟〕,自来水洗净,烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。
最后装入铝盒内高压灭菌。
3).塑料培养瓶,培养板及胶头:
用洗涤剂洗干净后,用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,凉干。
75%酒精浸泡过夜,超净台中吹干,紫外照射后使用即可。
3.考前须知
1)注意人体的防护和器皿的完全浸泡:
A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。
B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。
C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。
第4节培养用品的消毒灭菌及灭菌锅的使用
造成组织细胞培养失败的主要原因之一是发生污染,特别是微生物污染。
在细胞培养的实验过程中,有一半以上任务是培养用品的消毒灭菌。
防止培养物污染主要通过培养用品的消毒灭菌与实验人员的无菌操作技术来完成。
目前本实验中采用的消毒灭菌方法主要是湿热消毒、紫外线消毒及过滤除菌消毒。
1.湿热消毒〔121度,30分钟〕
常用且很有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。
高压蒸汽灭菌锅装置严密,输入蒸汽不外逸,温度随蒸汽压力增高而升高,当压力增至103~206kPa时,-132℃。
高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌。
适用于耐高温、高压,不怕潮湿的物品,如敷料、手术器械、玻璃器皿、培养瓶/皿、细菌培养基等。
1)操作方法如下:
1灭菌前,应检查灭菌锅中的水量,保持水位高于加热圈2cm左右。
2将拟灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内;将盖子上的排气软管插于铝桶内壁的方管中;盖好盖子,拧紧元宝螺丝,勿使漏气。
3翻开放气阀,调节变压器至220V,开始加热。
4排出锅内冷空气,关闭放气阀〔一般以空气急速排出2分钟左右为准〕,使压力逐渐上升至120kPa〔压力表中的指针应在中间位置左右〕,调节变压器,维持压力30分钟左右。
··
5灭菌完后,应先关掉灭菌锅的开关,拔掉电源插头,再将变压器调零。
6灭菌锅压力降至“0〞后,约10分钟,再慢慢翻开灭菌锅盖子。
如果突然开盖,冷空气大量进入,蒸汽凝成水滴,使物品潮湿,且玻璃类易发生爆裂。
2)考前须知:
1灭菌前必须检查锅内水位。
〔水量与小爪齐平〕
2灭菌时,各包裹不宜过大过紧,各包裹间要有间隙,使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。
3灭菌时,对于螺旋盖的瓶子,应使瓶口半松;对于胶塞的瓶子,应插入注射器针头,保持瓶子内的冷空气顺利排出。
灭菌完后,应立即拧紧瓶塞或拔掉针头〔多时须贴上胶布〕。
4液体灭菌时,液体体积以不超过3/4为宜。
5针式滤器及过滤装置,在进行高压灭菌时,要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),滤膜光滑一面是正面,否那么起不到过滤的作用。
3)不能高压灭菌的有:
1含有热不稳定组分,如血清、维生素、抗体和蛋白质等〔如BSA〕。
2哺乳动物、植物和昆虫的培养基。
3含HEPES的溶液。
4含有去垢剂的缓冲液,如10%SDS,会因为沸腾而溢出。
5含有二硫苏糖醇〔DTT〕或β-巯基乙醇〔BME〕。
6防止物质沉淀、变色及分解:
葡萄糖不能和含有氨基酸或磷酸盐的组分一起灭菌;磷酸盐不能和含有氨基酸或者其他矿物质盐溶液〔Ca2+〕一起灭菌;含有矿物质盐的溶液不能和琼脂一起灭菌;不要在pH6.0一下灭菌琼脂溶液。
2.紫外线消毒
紫外线直接照射消毒是目前实验室中常用的方法之一,主要用于实验室房间里的空气、超净工作台、桌椅外表等消毒。
同时,紫外线消毒也是我们常用于塑料培养皿〔塑料培养板、培养瓶等〕的消毒。
3.过滤除菌消毒
对于不宜采用高压灭菌的液体,如培养基、血清等,可采用过滤方法以去除细菌等微生物。
本实验室中主要采用抽滤式装置和针孔注射式滤器两种方法。
具体采用那种方法,主要依赖于滤液的体积,对于体积较大的,如1L培养基及缓冲液等,可采用抽滤式装置,对于体积较小的〔<200ml〕,可采用针孔注射式滤器。
不管那种方法,我们采用的滤膜均为μm孔径的滤膜。
第5节常用缓冲液、胰蛋白酶消化液及培养基的配制
平衡盐溶液是组织细胞培养中常用的根本溶液,用于维持渗透压,调节以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。
目前,在细胞培养及实验过程中,我们经常会用到一些缓冲有磷酸盐缓冲液〔PBS〕,Hank’s,D-Hank’s,KRPH,HBSS等缓冲液。
各种缓冲液的主要不同点在于NaCl的浓度、离子的浓度及缓冲系统的不同。
1.PBS配制〔1L〕:
NaCl8g
Na2HPO4·12H2O2.08g
KCl0.2g
KH2PO4g
注意:
在800ml双蒸水中依次溶解上述试剂,调节pH至7.4,然后定容至1L。
用途:
1)配制EDTA、胰酶、胶原酶;2)冲洗组织和细胞。
保存:
高压灭菌,4℃保存。
2.Hank’s配制〔1L〕:
NaCl8g
Na2HPO4·12H2O0.134g
KCl0.4g
KH2PO40.06g
MgSO40.1g
葡萄糖1g
CaCl20.14g
注意:
A:
在800ml双蒸水中依次溶解前六种试剂,为A液。
B:
用小体积〔2ml左右〕溶解CaCl2,为B液。
C:
在持续搅拌下,将B液缓慢滴加进A液〔不宜滴加过快,负责会产生沉淀〕。
D:
定容至1L。
用途:
冲洗组织和细胞。
保存:
过滤除菌,4℃保存。
3.KRPH配制〔1L〕:
NaCl7.54g
KCl0.36g
KH2PO40.16g
MgSO40.15g
NaHCO30.42g
HEPES2.4g
CaCl20.28g
注意:
A:
在800ml双蒸水中依次溶解前六种试剂,为A液。
B:
用小体积〔2ml左右〕溶解CaCl2,为B液。
C:
在持续搅拌下,将B液缓慢滴加进A液〔不宜滴加过快〕。
D:
定容至1L。
保存:
过滤除菌,4℃保存。
4.胰蛋白酶消化液配制:
在进行原代培养过程中需分散组织、细胞,在传代中要使细胞脱离附着的底物时均常使用消化液。
本实验室采用的消化液主要有两种:
0.25%胰蛋白酶消化液、0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液。
具体采用什么消化液,操作者应根据自己实验情况,相应调整胰蛋白酶的浓度,比方在进行人脐静脉内皮细胞〔HUVEC〕原代别离时,采用的是0.1%的胰蛋白酶消化液。
注意,配消化液所用溶液均为无Ca2+、Mg2+的缓冲液〔如PBS〕。
1)0.25%胰蛋白酶消化液〔100ml〕
A:
称取的胰蛋白酶;
B:
参加PBS液100ml;
C:
磁力搅拌,使其完全溶解〔一般搅拌1h以上〕;
D:
过滤除菌,4℃保存。
2)0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液〔100ml〕
A:
称取的胰蛋白酶,参加PBS缓冲液50ml,搅拌充分溶解;
B:
称取EDTA,参加PBS缓冲液50ml,搅拌充分溶解;
C:
将混合两种液体,过滤除菌,4℃保存。
注意:
一般情况下,后一种消化液的消化能力要强于前一种。
每次新配的消化液,应对其消化时间进行摸索。
5.培养基的配制:
培养基是维持体外细胞生存和生长的根本溶液,是组织细胞培养最重要的条件。
我们在实验室中常用的是干粉培养基,如RPMI1640,DMEM,M-199,MEM,F-12等。
每种细胞具体用什么培养基,请参考文献或ATCC网站〔.〕。
1)配之前,请先仔细阅读下培养基袋子上的标签,看哪些物质已有,哪些是没有的,如丙酮酸钠,谷氨酰胺,NaHCO3等,没有的话,需要额外补加。
2)取1L的锥形瓶,洗净,放入搅拌子,倒入约300ml的双蒸水,开启搅拌器搅拌。
3)用剪刀将培养基袋剪一个三角口,尽可能一次性将培养基倒入锥形瓶,再用装双蒸水的洗瓶将袋子里的培养基冲洗干净,全部转移到锥形瓶中。
4)加水至800ml左右,搅拌约3h,参加双抗〔青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml〕及NaHCO3〔DMEM,gRPMI1640,MEM,gM-199〕等,继续搅拌1h。
5)用稀盐酸或NaOH调节pH至~0.2〕。
6)定容至1L,过滤除菌,分装,4℃保存。
第6节细胞培养、换液、消化传代
每个人在第一次接触一种新的细胞株时,应对其细胞形态、生长速度有个明确的认识,这个过程可能需要一周左右〔指熟练的人〕。
细胞形态的观察可以先参考一些资料,比方ATCC网站上或一些文献中的照片。
体外培养的细胞,按其生长方式主要分为贴壁细胞与悬浮细胞两大类。
这两大类细胞在细胞换液与传代时的方式截然不同。
1.培养基颜色的观察
培养基的pH直接影响到细胞的生长状况,大多数细胞的最适pH为7.4左右。
2.血清的使用
血清可以提供细胞生长所必需的生长因子和营养元素。
我们常用的血清为小牛血清,培养基中血清的浓度为10%。
具体选择什么样的血清及血清的浓度,应根据细胞生长的特点而定,有些细胞可能需要胎牛血清,而有些细胞特别是转化后的细胞,对于血清的需要量是很低的,在0.5%左右。
A:
血清一般在-20℃保存;
B:
体积较大的血清,融化后应分装后,-20℃保存;
C:
对于未灭活的血清,在常温下溶解后,56℃水浴中灭活30min,再分装于-20℃保存。
3.细胞换液
细胞何时换液,依赖于细胞生长速度、细胞密度等。
一般情况下,2~3天更换一次。
同时也可以根据培养基的颜色进行判断。
培养瓶从孵箱中拿出来后,最好竖立着放,不要平放〔培养基易冲出瓶盖,导致染菌〕,包括在超净台中的操作。
1)贴壁细胞
D:
倒掉旧的培养基;
E:
用PBS清洗:
参加PBS,轻轻摇荡,倒掉〔这步并非必须的,视细胞生长情况而定,一般在消化传代后第一次换液时,最好用PBS清洗〕;
F:
参加新的培养基〔一般中小号培养瓶,4~6ml左右〕。
2)悬浮细胞
A:
培养瓶中培养基不多时:
直接参加新培养基〔培养瓶可以竖立着放〕;
B:
培养瓶中培养基过多时:
将细胞连同培养基一起转移到离心管中,1000rpm,5min;倒掉上清液,参加新的培养基到离心管中,吹打成细胞悬液,转移到培养瓶中继续培养。
4.细胞消化传代
贴壁细胞一般采用消化传代法;局部贴壁生长细胞〔半贴壁细胞〕可直接吹打即可传代;悬浮细胞可采用直接吹打或离心后传代。
贴壁细胞:
A:
倒掉培养基;
B:
参加PBS清洗〔必须,清洗掉含血清的培养基,一方面可以节约消化液,又能尽快的消化细胞,并且好控制消化时间〕;
C:
参加消化液以覆盖住细胞为准,不宜过多,37℃孵箱中消化2~3min左右;
D:
显微镜下观察,发现细胞质回缩、细胞间隙增大后〔细胞变圆〕,立即参加1-2ml含血清的培养基终止消化,弃去;
E:
重新参加1-2ml含血清的培养基,用移液管或移液枪吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打时应从瓶底一边开始到另一边,以确保瓶壁上细胞均被吹打下来。
〔吹打不宜过猛,防止过多的泡沫形成〕
F:
吹打均匀,细胞计数后,吸取适宜数量的细胞悬液,至新培养瓶中,再补足培养基〔50ml培养瓶可加4-5ml培养基〕。
悬浮细胞:
操作同上述悬浮细胞换液,仅是在细胞计数后,将适宜数量的细胞悬液,分配到新培养瓶中。
注意:
A:
不应待细胞长得特别满的情况下,消化细胞,因为这时细胞的活力并非最好。
应选择在对数生长期的细胞〔密度大约为90%〕进行消化传代或冻存
B:
对于贴壁细胞,消化传代后第二天〔细胞一般情况下已经贴壁了〕,用PBS清洗,换成新培养基。
C:
对于贴壁细胞,消化吹打成细胞悬液时,也可先将细胞悬液转移到离心管中,离心,倒掉上清液,加新培养基吹打成悬液,细胞计数后再分配。
D:
对于某些细胞贴壁较慢或难的细胞,细胞培养皿可以先用一些非特异性的物质修饰,这些物质可能带正电,如明胶或多聚D型赖氨酸处理〔新的一次性塑料培养皿不需如此处理〕,再参加细胞悬液。
具体操作:
1将玻璃培养瓶高压灭菌;
2参加明胶或多聚D型赖氨酸,37℃孵箱放置30min以上;
3回收明胶或多聚赖氨酸;
4将细胞悬液参加培养瓶中。
~0.5%。
例如,取明胶参加100ml双蒸水中,60℃左右水浴加热溶解,高压灭菌,4℃保存。
第7节细胞计数
1.血球计数板的使用
血球计数板一般有二个小室,每个室中细刻9个1mm2大正方形〔见下列图〕,其中上下左右4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为。
血球计数板上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2××10-4ml。
使用时,计数4大正方形内之总的细胞数目,求平均值,再乘以104,即为每ml溶液中细胞数目,再乘以稀释倍数,即可得出母液中细胞的浓度。
2.计数
A:
用酒精棉将计数板与盖玻片擦干净;
B:
盖玻片平稳地盖在计数板的中间,盖玻片与计数板的边缘相距左右;
C:
用移液枪取20μl左右细胞悬液,滴加到盖玻片与计数板的边缘空隙处,让液体通过毛细管现象自然吸附进盖玻片下计数板的小室中;
D:
显微镜下统计4个方格中的细胞数目,求平均值,即可得到细胞悬液中细胞浓度,〔比方:
四个方格中的细胞数分别是15、18、17和14,平均为16,那么细胞浓度为16×104×105个/ml〕。
E:
或者吸10μl细胞悬液到一离心管中,参加10μl台盼蓝染液〔%〕或苯胺黑,活细胞不会被染色,参加染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
如细胞密度太高,可稀释后计数。
〔细胞悬液的细胞数〕/ml= 〔 四个大格子细胞数/4〕×104×稀释倍数
F:
用完后用纸或酒精棉擦净计数板上的液体。
注意:
A:
计数时应注意一个原那么“压上不压下,压左不压右〞,也就是说计数时,如果将方格上方边缘线上细胞统计了,那么方格下方边缘线上的细胞就不用统计了。
如下列图,如果上面压边线的白色球统计了,那么下方压边线的黑色球就不用统计在内了。
B:
吸取的液体不宜过多,否那么计数不准,要靠盖玻片下毛细管作用将液体填充到小室中。
C:
细胞一定要吹打均匀后才可计数。
3.试剂的配制:
4%台盼蓝母液:
称取4克台盼蓝,参加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用液:
使用时,用PBS稀释母液至0.4%即可。
第8节细胞复苏与冻存
1.细胞复苏〔快速复苏〕
1)取一250ml烧杯或一废液缸装上38~39℃温水;
2)从-70℃或液氮罐中迅速取出所需细胞冻存管,放入温水中,快速摇晃,使其尽可能快的融化〔最好控制在1min左右〕;
3)完全融化后,立即从水中取出,1000rpm,离心5min;
4)冻存管外面用75%酒精喷洒并擦拭,移至超净台中;
5)在酒精灯火焰上灼烧后,小心揭掉冻存管上的胶布,将冻存管中上清液倒掉,参加培养基,轻轻吹打;
6)再将细胞悬液转移至培养瓶中,参加充足的培养基,吹打均匀,孵箱培养。
2.细胞冻存〔慢冻4℃冰箱30min,-20℃放置2h,-70℃存放〕
1)取对数生长期的细胞〔细胞密度约为90%左右〕,用PBS清洗一遍,参加消化液,消化,含血清培养基终止消化后,离心。
2)在超净台中,倒掉上清液,参加冻存液〔培养基:
血清:
DMSO=7:
2:
1〕,吹打均匀,将细胞悬液转移至冻存管中〔体积不宜过满〕。
3)用胶布封好冻存管接口处,在冻存管中说明细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人名字。
4)将冻存管放入4℃冰箱30min,再转移至-20℃,放置2h,最后转移至-70℃存放〔有条件的话,在-70℃过夜后,可将细胞转移至液氮中长期保存〕。
也可将冻存管用棉花包裹后,直接放入-70℃。
总之,冻存时掌握一个原那么,慢冻〔降温速度为1~3℃/min〕。
第9节MTT法测定细胞活力或细胞增殖
MTT储存液:
用PBS配置5mg/mlMTTμm滤膜过滤除菌后,4℃保存。
MTT工作液:
用无血清培养基按照1:
10稀释后使用。
操作流程:
去除或不去除原培养液按照1:
10的比例参加MTT(如90μL培养基,10μLMTT)在培养箱中孵育1-4小时〔视细胞类型及密度而定〕去除染色液参加100或150μLDMSO振荡器振荡10min使结晶溶解酶标仪检测
考前须知:
1)MTT的检测波长有单波长490,570或双波长570-650等,如选择单波长那么最好提前对本底进行扫描;
2)如所测细胞为悬浮细胞或贴壁不牢,那么应离心〔1000rpm,10-20min〕后再去除染色液,参加DMSO;
3)参加DMSO振荡后,请及时测定,否那么颜色会越来越深,影响测定结果。
第二章分子实验操作
第1节PCR引物设计与实验操作
1.引物设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对适宜的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。
如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长
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- 中药 复方 研究室 细胞 分子 实验 操作 指南