Bmp2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的.docx
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Bmp2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的
Bmp2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的时空表达
张颖,陈伟呈,黄国英
作者单位:
201102复旦大学附属儿科医院心血管中心(张颖、陈伟呈、黄国英)
通讯作者:
黄国英
通讯作者地址:
上海市闵行区万源路399号,201102
通讯作者电子邮箱:
gyhuang@
基金项目:
国家自然科学基金(30772337);
教育部博士点基金项目(20060246060)
上海市科学技术委员会科研计划(08JC1402800);
国家重大科学研究计划项目(973项目)(2010CB529505)
Bmp2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的时空表达
张颖,陈伟呈,黄国英
【摘要】目的利用Cx43基因敲除(KO)小鼠模型,观察骨成形蛋白(BoneMorphogeneticProtein,BMP)2在心脏近端流出道隔的表达,探讨Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔心肌化异常与Bmp2的关系。
方法 以胎龄(Embryonicday,ED)12.5—14.5的Cx43基因敲除纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)和野生型(Cx43+/+)小鼠胚胎作为研究对象,采用PCR方法鉴定其基因型,免疫组织化学法测定Bmp2和α-SCA的表达。
结果 Cx43KO鼠胚心脏近端流出道隔心肌化细胞明显减少,尤其以ED13.5和ED14.5的Cx43-/-为著。
ED12.5和ED13.5,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜均有Bmp2表达,心室肌也有微弱的表达;Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏仅心房和心外膜区有Bmp2的微弱表达。
ED14.5和ED15.5,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmp2表达,流出道隔未心肌化区域Bmp2未表达,这与α-SCA的表达一致;ED14.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmp2表达,而心室肌、流出道膈未见Bmp2表达;ED15.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmp2表达,而且Bmp2在流出道膈未心肌化区域部分表达。
结论 Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔存在明显心肌化延迟。
Bmp2在Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的表达明显落后于Cx43+/+胎鼠,且在未心肌化区域出现了异常表达,提示Bmp2很可能参与了Cx43-/-鼠胚心脏近端流出道隔心肌化异常的发病机制中。
【关键词】骨成形蛋白2;间隙连接蛋白;基因剔除;心肌化;免疫组织化学;小鼠;
Spatio-temporalexpressionofBmp2inmyocardializationofcardiacproximaloutflowtractseptuminCx43knockoutembryonicmice
ZHANGYing*,CHENWei-cheng,HUANGGuo-ying
*PediatricHeartCenter,Children’sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China
Correspondingauthor:
HUANGGuo-ying,Email:
gyhuang@
[Abstract] Objective Toobservethespatio-temporalexpressionofbonemorphogeneticprotein(BMP)2inproximaloutflowtract(OFT)septuminconnexin(Cx)43knockout(KO)miceandinvestigateitsrelationshipwiththeabnormalmyocardializationofcardiacproximalOFTseptuminCx43knockoutembryonicmice.Methods ObjectswereC57/BL6miceofED12.5toED15.5,whichincludedCx43homozygotes(Cx43-/-),heterozygotes(Cx43+/-)andwild-types(Cx43+/+)genotypedbyPCRmethod.Bmp2andα-sarcomericacti(α-SCA)weredetectedbyimmunohistochemistry.Results Theexpressionofα-SCAintheproximalOFTseptumwasdelayedobviouslyinCx43-/-predominantlyatED13.5andED14.5.AtED12.5andED13.5,Bmp2expressionwasdetectedincardiacatriumandepicardiumofCx43+/+fetalheart,andBmp2expressedinventricularmuscleslightlyofCx43+/+fetalheart,Bmp2expressedonlyincardiacatriumandepicardiumslightlyofCx43+/-andCx43-/-fetalheart.AtED14.5andED15.5,Bmp2expressionwasdetectedobviouslyincardiacatrium,epicardium,endocardium,trabeculum,ventricularmuscleandOFTseptumofCx43+/+fetalheart.AtED14.5,Bmp2expressionwasdetectedobviouslyincardiacatrium,epicardium,endocardium,andtrabeculumofCx43+/-andCx43-/-fetalheart,withoutventricularmuscleandOFTseptum.AtED15.5,Bmp2expressionwasdetectedobviouslyincardiacatrium,epicardium,endocardium,trabeculum,ventricularmuscleandOFTseptumofCx43+/-andCx43-/-fetalheart,Bmp2expressionwasalsodetectedobviouslyintheOFTseptumofCx43+/-andCx43-/-fetalheart,whichhasnotcompletedmyocardialization.Conclusions Cx43KOembryonicmiceexhibiteddelayedmyocardialization.AscomparedwiththeCx43+/+,theexpressionofBmp2inproximalOFTseptumdelayedobviouslyinCx43+/-andCx43-/-mice,andtheexpressionofBmp2inOFTseptumofCx43+/-andCx43-/-fetalheartisabnormal.Bmp2mayinvolveintheabnormalmyocardializationofcardiacproximaloutflowtractseptuminCx43knockoutembryonicmice.
[Keywords] Bmp2;Cx43;Geneknockout;Myocardialization;Immunohistochemistry;Mice
先天性心脏病(先心病)在新生婴儿中的发病率约6‰~10‰,其中心脏圆锥动脉干畸形(Conotruncaldefects,CTD)约占33%~38%,是常见的复杂型先心病。
心脏发育是一系列错综复杂的机制在时间和空间上精确配合的结果[1],其中流出道对于圆锥动脉干的发育起到了举足轻重的作用。
心脏近端流出道隔是指半月瓣水平及瓣下的流出道分隔,此隔最初是由心内膜嵴形成的一个间充质形式的垫组织,在心脏发育过程中,近端流出道隔的间充质成分逐渐为心肌成分所取代,此过程称被为“心肌化”。
这个过程是流出道隔发育过程中的一个非常重要的事件,心肌化障碍可导致流出道的结构和功能异常。
细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)是连接蛋白家族中的重要一员。
作为一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞迁移、分化、增生等相关的信号物质,在胚胎发育中起重要作用。
1995年,Reaume等[2]通过将不含启动子的neo基因导入胚胎干细胞进行同源重组,制造出Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠,其中纯合敲除(Cx43-/-)小鼠在出生后不久即出现紫绀、呼吸困难而死亡,解剖发现肺动脉圆锥部明显膨胀并阻塞。
近年来,一些参与并影响心肌化过程的分子机制相继被提出,Tgfβ/Bmp信号通路在心肌化过程中的作用引起了学者们的关注。
本课题先前的研究证实[3],Cx43-/-小鼠心脏近端流出道隔心肌化过程异常,并发现Tgfβ/Bmp信号通路中Bmp2等蛋白的编码基因存在差异性表达,提示这些细胞因子有可能参与了心肌化异常的发生。
为此,本研究利用Cx43基因敲除(Knockout,KO)小鼠模型,旨在研究Bmp2在Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的时空表达规律;以期发现Bmp2与心肌化异常之间的关系;试图进一步揭示Cx43KO小鼠圆锥动脉干畸形的发病机理。
材料与方法
一、材料
Cx43KO小鼠的遗传背景为C57/BL6,由Cx43+/-小鼠交配获得(Cx43+/-小鼠由美国国立健康研究院心脏发育实验室CeciliaLo教授惠赠,于清洁级环境繁殖喂养,12小时循环光照)。
选取2月龄Cx43+/-雌鼠与雄鼠,以2∶1比例于晚8点合笼交配,次日晨8点检查雌鼠阴道,出现阴栓者其胚胎定为ED0.5。
取ED12.5至ED15.5的纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)和野生型(Cx43+/+)胎鼠各8~10只为研究对象。
二、方法
1.基因型鉴定:
从胚期的卵黄囊或小鼠尾巴提取所需DNA,参考文献[2]采用PCR法进行鉴定。
PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离。
电压80V,25min后紫外灯显影。
根据基因型分为:
Cx43-/-、Cx43+/-及Cx43+/+。
2.标本处理:
颈椎脱位处死孕鼠后,剪开孕鼠腹腔,暴露子宫,将子宫从孕鼠体内取出,置于0.01mol/LPBS液中剥离出胚胎。
用于免疫组化的胚胎置于新鲜配置的中性甲醛(1:
10)固定12~24小时,根据胚胎大小的不同进行常规脱水、浸蜡、包埋,切7μm厚石蜡切片。
3.免疫组织化学法:
采用两步法。
肌节肌动蛋白α-SCA抗体购自Sigma公司,Bmp2抗体购自Abcam公司。
主要步骤:
石蜡切片常规脱蜡至水;加入1.5%H2O2—甲醇封闭内源性过氧化物酶30分钟;加入PBS5分钟;柠檬酸盐缓冲液高温抗原修复10min;恢复至室温后,用PBS洗3×5分钟;加血清封闭剂于切片,37℃20min;吸去封闭剂;加入PBS稀释的一抗(抗α-SCA为1:
300,抗Bmp2为1:
200);4℃孵育过两夜;PBS洗3×5分钟;加二抗于切片,37℃30min;PBS洗3×5分钟;DAB(Sigma公司)显微镜下显色;ddH2O冲洗终止反应;中性树胶封片(DAB)。
结 果
1.基因型测定结果
基因型的鉴定结果如图1。
引物Cx43-3′和Cx43-5′扩增出1条约500bp的野生型(WT)位点的片段。
引物Cx43-3′和引物Neo-5′扩增出1条约1kb的剔除(KO)位点的片段。
仅有1条500bp的片段者为Cx43+/+,仅有1条1kb片段者为Cx43-/-,2条都有者为Cx43+/-。
图1 胎鼠基因型鉴定PCR产物电泳图
注:
PCR产物中含有1000bp和500bp片段的是Cx43+/-(#2,5,6,7);只含有1000bp的是Cx43-/-(#3);只含有500bp的是Cx43+/+(#1,4)。
2.心脏近端流出道隔α-SCA的表达
野生型小鼠(Cx43+/+)心脏近端流出道隔α-SCA的表达从E12.5开始,α-SCA阳性细胞表现出从近端流出道隔外侧向间质性心内膜垫内生长趋势,E13.5及E14.5心肌继续逐渐向内长入,至E15.5流出道隔几乎完全被心肌成分覆盖。
整个心肌化过程呈现心肌从流出道隔由外向内的内向性生长趋势。
Cx43KO小鼠α-SCA在胚胎期心脏近端流出道隔心内膜垫组织的表达减少和滞后,尤其是在E13.5和E14.5,以Cx43-/-为著:
小鼠心脏近端流出道隔中央区域出现明显未着色区域,E1515小鼠心脏近端流出道隔中央区逐渐被α-SCA阳性细胞覆盖(图2,3)。
3.各基因型小鼠心脏近端流出道隔Bmp2的表达
ED12.5和ED13.5,Cx43+/+胎鼠心脏的心房,心外膜均有Bmp2表达,心室肌仅有少许的表达,流出道膈未见Bmp2表达;Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房和心外膜区有少许Bmp2表达,心室肌、流出道膈未见Bmp2表达。
ED14.5和ED15.5,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmp2表达,流出道隔未心肌化区域Bmp2未表达,这与α-SCA的表达一致;ED14.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmp2表达,而心室肌、流出道膈均未见Bmp2表达;ED15.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔均有Bmp2表达,Bmp2在流出道膈已心肌化区域全部表达,在流出道膈未心肌化区域部分表达。
(图2,3)。
图2免疫组化DAB显色显示α-SCA与Bmp2在EDl2.5~EDl3.5胎鼠心脏的表达LV:
左心室,RV:
右心,AOV:
主动脉瓣,Bar=100μm,α-SCA与Bmp2均为DAB显色,苏木素复染;1A~ID:
Cx43+/+,2A~2D:
Cx43+/-,3A~3D:
Cx43-/-;由图中可见,在心肌化的初始阶段,Cx43+/+胎鼠心脏仅心房,心外膜有Bmp2表达,而Cx43-/-和Cx43+/-胎鼠心脏的表达要弱于Cx43+/+。
图3免疫组化DAB显色显示α-SCA与Bmp2在EDl4.5~EDl5.5胎鼠心脏的表达LV:
左心室,RV:
右心,AOV:
主动脉瓣,Bar=100μm,α-SCA与Bmp2均为DAB显色,苏木素复染;1E~1H:
Cx43+/+,2E~2H:
Cx43-/-;3E~3H:
Cx43-/-;Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁及心肌均有Bmp2表达,与α-SCA的表达一致,如箭头所示,未心肌化区域未见Bmp2表达;ED14.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmp2表达,而ED15.5的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁及心室肌均有Bmp2表达,如箭头所示,Bmp2在流出道膈未心肌化区域出现了部分表达。
讨论
先天性心脏病的发病机理至今仍不明,基因突变被认为是重要原因。
1995年,Reaume等[2]发现,Cx43-/-小鼠在出生后不久即出现紫绀、呼吸困难而死亡,解剖发现圆锥部明显膨胀并阻塞。
同时,磁共振、宫内心超及胚胎切片分析均表明右心室和流出道发育异常[4]。
但对于该流出道梗阻的发生机制目前尚无定论。
Ya等[5]发现,在ED12.5,Cx43+/+和Cx43-/-之间无明显形态学差异。
而本课题组赵晓晴等[6]曾发现Cx43-/-鼠胚在ED12.5至15.5右室流出道隔心肌化异常,并以ED13.5和14.5异常最为明显。
BMPs是一种引导内皮-间充质转化的生长因子,TGFβ超家族中的成员。
以往的许多研究都表明,TGFβ超家族许多成员都引导内皮-间充质转化中起作用。
利用Cre/lox系统特异性地敲除心肌细胞的BMPII型受体ALK3/BMPRIA后,房室间心内膜垫发育出现不全,而且TGFβ2在心肌细胞中的表达下调[7]。
而条件性敲除Bmpr2基因后,BMPII型受体与配体的结合能力受抑制,出现永存动脉干和主动脉弓离断等异常[8]。
本课题组先前的研究[3]发现,Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔的多个基因表达差异,并筛查出了8个与心肌化相关的关键基因。
其中TGFβ/BMP信号通路的多个基因的表达都出现异常,包括Bmp2;在mRNA水平上,Bmp2基因在Cx43KO胎鼠心脏近端流出道部位的表达下调。
本研究针对Bmp2进行了蛋白水平的形态学的研究,发现Cx43KO胎鼠的心肌化过程是延迟的,并且发现在ED14.5和ED15.5,心肌组织的区域都出现了Bmp2表达,而未心肌化的区域未见Bmp2表达,在野生型小鼠上的表达是与肌动蛋白的表达一致的,这提示了Bmp2是与心肌细胞存在一定关联的。
再进一步地,相比于相同胎龄的Cx43+/+胎鼠,Bmp2在Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的表达明显减弱且迟滞,这与先前的研究结果所发现的Bmp2在mRNA水平上的表达下调的结果是一致的。
对于野生型胎鼠,ED12.5与ED13.5的Bmp2表达范围较小,而ED14.5表达明显增强,尤其在心室肌和流出道隔,Bmp2在这个心肌化最为显著的时间内表达量猛增。
而对于杂合子与纯合子胎鼠的表达迟滞了约一天,但时空表达规律相似,这表明Bmp2在心肌化具有非常重要的作用,更为有意义的是,在ED15.5未心肌化区域出现了Bmp2的异常表达,此现象表明,在Cx43敲除后,Bmp2不仅表达量下调,而且表达的部位也出现异常,这些都提示Bmp2很可能是Cx43基因敲除引发鼠胚心脏近端流出道隔心肌化异常的机制中极其重要的一环。
由于心脏的发育过程是一个精细配合的复杂的过程,Cx43基因敲除之后,将会影响到多种信号传导途径,最终导致流出道部发育异常。
此前国内外关于心肌化过程的研究日益深入,发现了越来越多的基因敲除或是条件敲除后,都会影响心肌化的过程,这也有助于我们利用Cx43-/-小鼠模型来研究其作用机制。
Cx43作为细胞间的缝隙连接蛋白,以往并没有很多证据表明它参与信号通路或某种调控机制的过程。
但是近年来,逐渐有研究者发现,Cx43通过和其他蛋白结合伴侣如信号蛋白α-β连环蛋白、连环蛋白p120ctn,结构蛋白ZOl、小凹蛋白1,膜蛋白如钙粘蛋白,以及与细胞骨架相关的蛋白如a2辅肌动蛋白、微管等的结合;与介导细胞粘附、细胞活动和细胞骨架的信号通路发生联系。
这些都赋予Cx43结构蛋白以外的其他定义和功能。
本次研究的结果也很好地验证了这一点。
而且,最新的研究显示,构成胚胎发育时期流出道心肌层的细胞来源,即第二生心区的细胞在迁移到流出道之前表达Cx43。
国内外的研究都表明,Bmp2的表达与细胞连接有关;本研究发现Bmp2在Cx43KO胎鼠心肌化过程中的表达出现异常,强烈提示该蛋白在心肌化过程中的重要作用,更加深入地研究Bmp2基因,将有助于更加深刻地阐述其作用;另外一方面,扩展研究的广度,研究TGFβ/BMP信号通路其他相关基因,将有助于从信号通路水平阐述心肌化异常的机理。
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