适用于荧光成像的化学发色团与生物正交反映研究进展.docx

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适用于荧光成像的化学发色团与生物正交反映研究进展

适用于荧光成像的化学发色团与生物正交

反映研究进展

张艳①,陈鹏②,姚祝军①*

①南京大学化学化工学院,南京210093;

②北京大学化学与分子工程学院,北京100871

*联系人,E-mail

2013-02-27收稿,2013-04-24同意

国家重点基础研究进展计划（2010CB833202）和国家自然科学基金（）资助

摘要荧光成像是一种融合多门现代学科的显像方法,其运用荧光成像探针实现对细胞及动物体内的生物大分子的动态、可视化观察,为疾病的诊断与治疗提供了有力的方法.理想的荧光发色团和细胞环境友好的生物正交反应是构建性能优良的活细胞荧光成像探针的两大因素,本综述总结了近年来在荧光发色团及生物正交反应方面最新的研究进展.

关键词

荧光成像

生物大分子

荧光发色团

生物正交反应

定量生物学

荧光成像是融合了有机化学、光化学、生命科学等学科为一体的显像方式,其运用光化学原理,结合现代有机合成技术,设计和构建荧光功能分子,成立和进展细胞及动物体内的荧光成像方式,实现了对生物大分子的原位、实时、动态研究,为揭露生物机制、诊断与医治疾病提供了有力的方式;这一领域凸显了现代多学科交叉的典型特点.这些研究中,针对具有重要生物学意义的大分子目标进行合理的标记方案设计并通过实验取得真实靠得住的成像信息是十分关键的.为此,两个方面的保证是必需的:

第一,作为“报告者”的荧光发色团的化学和光学性质在实验体系下足够优秀;第二,取得的数据（往往是化学转变致使的光学性质改变）能够真实反映生物大分子定位和定量的转变信息.为了保证后者不为实验环境等背景因素所干扰,实验荧光探针（分子装置）和研究目标之间必需能专一性地彼此识别.生物正交反映是指能够在生物体内的生理环境中发生,与其中的各类反映互不干扰,不会受到其中各类生物分子的影响,而且也不会对生物体或目标生物分子造成损害的一类化学反映.这种化学反映的进展能够使咱们在分子尺度上修饰、标记和改造生物大分子,并由此探索细胞信号传导路径,揭露疾病发病机理,了解生命进程机制.生物正交反映最终将会实现对各类活体生物的生理进程进行调控,并对人类疾病的预防和医治产生深远影响.将荧光发色团与能够发生生物正交反映的官能团相结合,即可利用生物正交反映实现对细胞内特定靶标分子的荧光标记与成像,相关的研究为当前化学生物学领域的前沿与热点.本文将结合实例从荧光发色团与生物正交反映两方面综述最新的研究进展.

1荧光发色团

为了适用于生物成像的需要,化学发色团通常需要知足以下条件:

（1）荧光分子具有较好的水溶性和生物兼容性;

（2）对细胞具有较好的穿透性,容易进入细胞;（3）激发波长和发射波优势于可见或近红外区,以具有较好的组织穿透性和避免较高的激发能量破坏生物体的生理结构.目前常常利用于荧光成像的发色团主要分为3类:

（1）基于有机小分子的发色团如香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY和箐染料等;

（2）基于纳米材料的发色团如量子点、上转换纳米颗粒等;（3）生物大分子类荧光成像材料,如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等.这些荧光发色团和成像物质的进展为科学家们了解生命体系的复杂进程提供了有效的工具.本部份将简要介绍这3类荧光标记物的性质、应用及与此相关的最新研究工作报导.

有机小分子发色团

在数码时期彩色胶片市场日渐衰退的背景下,有机染料在影像技术领域又迎来了新的蓬勃进展.有机小分子发色团因其结构容易修饰,因此应用最为普遍.通过修饰,基于香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY和箐染料已经进展出了一系列的荧光发色团,其大多水溶性和生物兼容性较好,波长和性能通过结构修饰可调,已经被普遍进展成各类类型的荧光探针并应用到对各类生物分子的成像当中.如香豆素（coumarin）即是一类存在于植物界中的香豆素类化合物的母核（图1（a））,通过修饰其已经被进展成多种针对不同生物分子的荧光探针.锌离子（Zn2+）是神经系统中的一个重要的金属离子,其与许多的神经疾病如阿尔茨海默病和癫痫等都紧密相关,因此Komatsu等人[]针对Zn2+设计了一个基于香豆素的比例计量型荧光探针（图1（b））.该探针的最大吸收波优势于500nm左右,最大发射波优势于550nm左右,在与Zn2+结合后,其发射波长发生转变,558nm的发射增加而543nm的发射降低,因此能够用于对Zn2+的比例测量;其也已经被应用到对细胞及海马体组织中的Zn2+检测.双氧水（H2O2）分子也是生物体中一种重要的生物分子,与许多重要的生理疾病紧密相关.Du等人[则设计了一种以香豆素为基础的激活型荧光探针（图1（c））,该探针的最大吸收波长为400nm左右,而最大发射波长为480nm左右,且该探针在与H2O2作用后荧光能够增强5倍左右.为了研究抗生素类药物与细菌RNA间的作用,Xie等人[设计了一种以香豆素为基础的荧光共振能量转移（FRET）型荧光探针（图1（d））.该香豆素发色团吸收波长为400nm左右,发射波长为480nm左右,再结合发射波优势于400nm左右的尿嘧啶碱基,别离将这两个发色团接入抗生素和细菌RNA中,即可实现对二者之间作用的检测.

作为合成有机化合物,荧光素（fluorescein,图2（a））在蓝光或紫外光照射下能够发出绿色的荧光,是目前应用超级普遍的荧光发色团之一.Li等人[就以荧光素为基础设计了一种能够对组氨酸进行标记

图1香豆素类型发色团及荧光探针

图2荧光素类发色团及荧光探针

的荧光探针（图2（b））.该探针的最大吸收在480nm左右,最大发射在520nm左右,且在与组氨酸作用后,荧光增强;其也已经被成功用于对人血清中的组氨酸进行标记.利用光诱导的电子转移机制（PET）,Sparano等人[设计了一种自淬灭型的荧光探针（图2（c））.该探针在与RNA作用后,其PET进程会被破坏,因此荧光得以恢复.在荧光素中,还有一类应用最普遍的且已做生意业化的发色团,即异硫氰酸荧光素（FITC,图2（d））,已经被普遍应用于对RNA,DNA,蛋白和细胞的标记中[,].

罗丹明（rhodamine）是指一系列相关的萤光酮杂环化合物（图3（a））,其结构与荧光素类似,但波长相对较长,最大发射波长能够达到600nm左右.一样利用PET机制,Nagano课题组[]设计了一种能够靶向细胞中的活性氧（ROS）的自淬灭型荧光探针（图3（b））.该探针只有在碰到ROS时才会产生荧光,具有专门好的灵敏性和选择性,而且其也被证明能够在细胞的线粒体中对ROS进行成像.类似地,一样对RSH有着专门好的灵敏性和选择性的探针（图3（c））可靶向细胞中的活性巯基分子（RSH）产生荧光并已被成功用于对细胞的成像中.近来Nagano课题组[]报导了另外一种对次氯酸（HOCl）敏感的且发射波优势于近红外区的罗丹明荧光探针（图3（d））.该探针在与HOCl作用后,五元环将打开,荧光得以恢复.该探针对HOCl有着极好的选择性和敏感性,且在细胞和动物体内均表现出了较好的成像能力.

氟硼二吡咯（BODIPY）是另外一种常常利用的有机发色团（图4（a））,其通常发红光且水溶性较好,因此应用比较普遍.目前,在BODIPY的基础上已经进展出了一系列水溶性更好且波长更长的发色团,并按照其自身性质也已经取得了针对不同生物分子的荧光探针.Akkaya课题组[设计了一种针对生物巯基分子的荧光探针（图4（b））,该探针的发射波长能够达到660nm左右,而且其自身带有聚乙二醇结构,具有专门好的水溶性,适于生物体系检测.该探针利用PET机制,本身荧光处于淬灭状态,在碰到硫基分子后,荧光显著增强.Han课题组[设计了一种同时对HOCl和硫化氢（H2S）生物分子有响应的荧光探针（图4（c））,该探针一样基于PET机制,在与HOCl作用后,荧光显著增强;而在与H2S作用后,探针又回到原始状态,荧光减弱.体外实验证明该荧光探针对两种生物分子均有专门好的选择性和敏感性,细胞实验也证

图3罗丹明类发色团及荧光探针

图4BODIPY类发色团及荧光探针

实该探针具有专门好的细胞膜通透性,而且能够持续对两种生物分子进行检测.最近,大连理工大学彭孝军课题组[报导了一种基于BODIPY的、能够用作线粒体染色的荧光发色团（图4（d））.该发色团毒性小且稳固性较高,适用于长时刻显影,其在线粒体标记中显示出了比商业化线粒体染色剂更好的潜力.

箐染料（Cyanine）是指发色团共轭体系两头成立在N-N原子间的脒离子插烯物（图5（a））,其分子可修饰性强,吸收和发射波长较长,能够达到近红外区,且量子产率较高,因此相较其他有机分子染料,箐染

图5箐染料类发色团

料最适于体内显影.其中有很多箐染料已做生意业化,如（图5（b））,这些染料已经被运用于构建各类荧光探针并用于体内显影中[,].如Pham等人[]合成了一种相较于传统箐染料稳固性更高、水溶性好且发射波长能够达到800nm左右的近红外箐染料（图5（c））,该发色团可用于靶向癌症抗原的多肽标记并成功用于活体显影中.彭孝军课题组[,]也设计合成了一系列的箐染料（图5（d））,这些箐染料的发射波长都处于800nm左右,量子产率较高.

纳米材料发色团

由于有机小分子发色团量子产率相对较低,并非能完全知足体内显影的光强度需求.随着纳米技术的进展,量子点（QDs）以其较好的荧光性质吸引了科学家们的视线.相较于有机小分子发色团,量子点具有宽吸收、窄发射、高量子产率、优越稳固性和长荧光寿命等特性.另外,量子点在体内的循环时刻较长,适于体内显影.这些长处,使得量子点已经进展成为一种普遍用于生物成像中的荧光发色团.目前应用比较普遍的量子点多数是拥有核-壳结构的无机纳米材料（CdSe@ZnS,图6）,再通过对其表面进行修饰使其带有羧基或氨基以用于与其他生物分子相连.

通过将靶向整合素的短肽RGD接到量子点表面,量子点能够用于肿瘤血管靶向的体内成像[而将荧光素蛋白连接到量子点表面后,能够实现生物荧光共振能量转移（BRET）,并已成功用于体内成像中[,].另外将量子点作为FRET中发色团的一种,也已经实现了对各类蛋白酶的成像[这些例子都说明了将量子点作为发色团并用于体外、体内成像中

图6量子点类发色团的大体结构示用意

的潜力.

有机小分子发色团及量子点均属于常规荧光发色团,均由短波激发,发射长波.但是短波长的光在体内组织穿透性较差,而且生物体内的很多大分子在短波激发下会产生自身荧光,造成背景信号较深.与此相对,近红外光作为光源则能够规避这些缺点.近几年,拥有能够用近红光激发和发射紫外或近红外荧光特性的新型纳米材料-基于稀土元素的上转换纳米颗粒（upconversionnanoparticles）愈来愈引发人们的重视.该纳米材料一样拥有核-壳结构,目前最常常利用的结构为NaYF4（Yb,Er,Tm）@NaYF4（图7）.其原理基于其中相邻原子的能级轨道比较接近,在激发光的激发下,电子会从两个原子间的能级中持续跳跃,从而取得更高的能量[在电子回到基态时,则产生波长更短的紫外光或近红外光.目前常常利用的上转换纳米颗粒的激发波长为980nm,而发射波长按照搀杂的稀土原子不同或比例不同能够从紫外光转变到近红外光.

由于其独特的光学性质,上转换纳米颗粒已经被普遍应用于生物成像中.能够发射800nm左右近红外荧光的上转换纳米颗粒在2008年第一次被应用于

图7上转换纳米颗粒类发色团

体内成像中,而且成像结果也显示其在体内成像上的庞大优势[].随后,搀杂其他稀土金属原子或利用聚合物制得的上转换纳米颗粒均被证明能够用于体内成像中,且信噪比较高[,].在接上具有靶向功能的叶酸分子后,该类发色团呈现优良的成像性能[].

上述的两种纳米发色团相较于有机小分子发色团,均表现出了较强的体内成像能力.但其均由重金属组成,在生物应用方面的毒性问题将会给其进一步应用蒙上阴影,未来在优化其结构和生物兼容性方面仍需科学家继续尽力.

生物大分子荧光物质

荧光蛋白的应用在某种程度上能够说是革新了现代生物学的研究面貌.利用荧光蛋白能够观察细胞活动和标记表达蛋白.由于其较好的生物兼容性,荧光蛋白作为荧光发色材料的一种,在生物成像中具有普遍而重要的用途,例如使科学家们能够实现实时观测肿瘤细胞的生长、入侵、转移和新生.

最先出现的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）[,]是在水母中发觉的,其单体蛋白质由238个氨基酸组成,分子量约为27kD,在光激发下能够发出绿色的荧光.GFP的发光不需要辅助因子,不需要额外酶的参与,只需要氧气的参与,就可以够通过氨基酸之间的反映发出绿色的荧光.Shimomura,Chalfie和Tsien因在GFP研究中的突出奉献一路取得2008年诺贝尔奖.随着这一领域的进展,通过生物工程的手腕,科学家们也取得了GFP的各类变种,包括增强绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等.其中增强绿色荧光蛋白是水母荧光蛋白中亮度和稳固性最好的一种荧光蛋白[但是短波长的荧光蛋白并非能帮忙对生物体深层的组织进行成像,随着对远红外荧光蛋白的不断研究,Shcherbo等人[]成功取得了发射波优势于635nm的红色荧光蛋白.该蛋白的出现将大大提高生物体活体成像的质量,并在实时追踪活生物体内深层组织的分子活动上取得普遍的应用.

由于荧光蛋白具有各类长处,如易于构建,可通过生物工程方式导入活细胞当中进行活细胞的标记和成像;在不同的生物体系中具有通用性和兼容性,各类变种荧光蛋白已经普遍应用于基因表达的报告体系中[也包括pH、小分子、酶等成份的成像和蛋白间的彼此作用检测等[,].例如,利用FRET原理进行成像,将荧光蛋白作为荧光给体或受体,检测对象能够影响给体和受体之间的距离从而影响其荧光信号.这一手腕在蛋白酶的检测中取得了成功应用,两个荧光蛋白被一段能够被相应蛋白酶切割的肽链相连,在蛋白酶作用后,荧光则会发生转变[另外一种手腕是基于检测对象能够影响荧光蛋白的构型,从而影响其产生的荧光.近来产生的一类全新的检测策略,是将荧光蛋白分成两部份,检测对像的存在使两部份组合成整体从而发出荧光.该手腕已经被应用到蛋白彼此作用的检测中[而对pH的检测主要有两种手腕,一种是基于荧光蛋白的荧光光谱在不同pH下的转变,另外一种是基于由一种不受酸性条件影响的荧光蛋白和另一种可对酸性条件响应的荧光蛋白组成的比例荧光转变[,].这些荧光蛋白的应用,极大地拓宽了生物领域的研究,也极大地增进了化学生物学成像领域的进展.

上述3类荧光发色物质各自具有优缺点,针对不同的生物成像靶标选择不同的发色团或将其组合进行生物成像是目前的前沿研究热点.利用这些发色团进行生物成像,将显著地帮忙科学家们对生物体内各类生物分子进行实时、动态的研究.以GFP为代表的大分子发色团能够直接运用生物工程的手腕导入,对于生物学研究者来讲利用方便,可是由于其大小和研究目标八两半斤,存在干扰研究目标的较大可能性,这是它们的缺点.

2生物正交反映

生物正交反映是指能够在活体细胞内进行的化学反映[它们能够在生物体内的生理环境中发生,与其中的各类反映互不干扰,不会受到其中各类生物分子的影响,而且也不会对生物体或目标生物分子造成损害.因生命进程与生物分子的复杂性和脆弱性，生物正交反映的开发也具有相当大的挑战性,具体表此刻:

（1）活泼的亲核性及还原性有机基团,如羟基、氨基、巯基和羧基等在生物体系和生物分子中也大量存在;

（2）生物正交反映的发生需要相对温和的条件，因为生物体系与生物分子通常只能在中性、常温、水相溶液等环境下存在;（3）生物体系中存在多种不同的生物大小分子,而且每一种生物分子的浓度都超级低（一般为10-9~10-3mol/L）[39].这些对生物正交反映的限制条件使得传统的有机化学反映难以在生物体系中取得应用.因此,进展适用于研究生物体系和生物分子的生物正交反映,使其能够在生理环境下以高速度与高选择性进行,是当前化学、生物与医学交叉领域急需解决的瓶颈问题,并愈来愈受到人们的重视.生物正交反映能够将有机小分子标记物（如荧光染料和生物素）和生物大分子有效地偶联在一路,从而用于对生物大分子及其参与的生命活动进行可视化观察.目前常常利用的生物正交反映主要分为3类:

金属催化反映、光催化反映和无需催化剂的反映,咱们将一一介绍这3类反映及其最近的一些进展.

金属催化剂催化的生物正交反映

生物正交反映必需通过各类化学官能团之间的彼此作用实现,而在这种反映中效率最高、运用最普遍的是在亚铜盐催化下发生在叠氮与炔键之间的点击化学反映（clickreaction,图8（a））.这一反映在生物领域的应用最先由2001年诺贝尔化学奖得主BarrySharpless教授[40]第一提出,是一项用于对生物大分子进行标记的革命性技术.点击化学反映能够有效地对大肠杆菌和酵母中的蛋白进行标记[41,42],也已被用来对体内的蛋白进行标记和分析[43].虽然点击

表1各类荧光发色团的主要特性及优缺点

荧光发色团

特性及优点

缺点

有机小分子发色团

分子较小、容易获得及修饰、光谱范围较宽（紫外区至近红外区）

易被光漂白、斯托克斯位移较小、量子产率较低

纳米材料发色团

量子点

吸收及发射通过大小变化可调、耐光性强、吸收范围宽、量子产率高、斯托克斯位移较大

尺寸较大、毒性较大、稳定性不高

上转换纳米颗粒

激发波长处于近红外区、发射波长通过大小或稀土原子掺杂可调（紫外区至近红外区）

尺寸较大、毒性较大、量子产率较低

生物大分子荧光物质

生物兼容性好、可通过生物工程的方式对活细胞或活体内特定生物分子进行标记成像

易被光漂白、斯托克斯位移较小、尺寸大、易对目标生物大分子产生干扰

图8点击化学反映示用意

化学反映在化学生物学研究方面的应用已经得以证明,但由于其需要用到有毒的一价铜离子,因此其本身不具有生物兼容性.为了改善这一缺陷,化学家们开始寻觅能够降低一价铜毒性的配体,这种配体的进展极为迅速,目前已经进展出了几类能够用于无（低）毒点击化学的配体[图8（b））.这一新方式也已经被证明能够在活细胞表面进行标记[,].

结尾炔则能够在钯催化的条件下与碘代芳基间发生Csp3-Csp2偶联反映（sonogashirareaction,图9（a））,这一反映也已经被成功拓展到化学生物学领域.在钯与配体TPPTS的一路作用下,这一反映成功地在体外蛋白上标记上了生物素[而随着对配体的进一步优化和挑选,纽约州立大学Buffalo分校Lin课题组[]发觉一类新的配体DAP能够显著地改善这一反映的反映速度和产率,使其能够在生理环境下进行,随后这一反映也成功地对大肠杆菌细胞进行了荧光标记.除此之外,碘代芳基与二羟基硼基之间的Suzuki-Miyaura偶联反映也被进展成一种新型的生物正交反映（图9（b））.这一反映在钯与配体DBA的一路催化下能够用来对Z端蛋白进行荧光标记[随着对配体的进一步优化,ADHP配体被发觉能够显著地改善这一反映,使其能够在生理条件下进行,并已经成功地对体外蛋白和细胞膜表面的蛋白进行荧光标记[,].虽然钯催化的偶联反映已经被成功进展成为一种新型的生物正交反映,可是其所用的钯催化剂的毒性和细胞通透性仍然限制了其的生物学应用,因此进展加倍高效的新配体以进一步降低金属催化剂的浓度仍是目前急需解决的问题.

光催化的生物正交反映

除这些需要额外金属催化剂的生物正交反映之外,另外一类只需以光为催化剂的光点击化学反映（photoclickreaction）以其反映简单、迅速、产物单一的特性也被进展成了一类新型的生物正交反映（图10）.这一反映发生在四氮唑和双键之间,四氮唑在紫外光照射下,能够迅速产生1,3-偶极子并与双键进行加成.这一光点击反映已成功用来对绿色荧光蛋白进行标记[由于其反映产生的产物自身带有荧光,因此其不仅能够作为一种连接方式,也可作

图9钯催化的生物正交反映

图10光点击化学反映

为一种标记方式.Lin课题组[]成功地将photoclick反映运用到了在大肠杆菌中对修饰上烯烃的蛋白进行标记.

无需催化剂的生物正交反映

由于点击化学反映中一价铜的毒性问题,美国加州大学伯克利分校Bertozzi课题组[提出了通过八元环诱导的环张力来活化炔基,实现了无铜点击化学（图11）.这一改良版的点击化学反映已经被证明能够对细胞膜表面的生物蛋白进行标记[],也被应用于细胞表面和细胞中的多糖示踪.但是近来有愈来愈多的报导说明这一方式取得的炔键不够稳固,会和生物体内蛋白上的半胱氨酸的巯基侧链发生反映,从而造成很高的背景,进而限制了其在生物体内的应用.

而叠氮基团也被发觉能够与带有膦基的酯发生施陶丁格反映（staudingerreaction,图12）,这也是一类经典的无需催化的生物正交反映[这一反映一样能够在活细胞膜的表面引入标记基团[

利用环双键与四嗪（tetrazine）之间的强反映性能,特拉华大学Fox教讲课题组[也将狄尔斯-阿尔德反映（Diels-Alderreaction）进展成了一种生物正交反映（图13（a））.这种反式电子需求的狄尔斯-阿尔德反映反映迅速,产物单一,而副产物为氮气,因此也是一种理想的生物正交反映.这一反映已经被成功用于对硫氧还蛋白（thioredoxin）进行修饰.随后,哈佛大学的Hilderbrand课题组[又将这一反映进行优化,取得反映速度更快的方式,并成功地将这一反映用于对活细胞的选择性荧光标记中.与此同时,四嗪与桥环烯烃的狄尔斯-阿尔德反映（图13（b））也被用于生物体系的标记中,其被用来对血清和细胞中的抗体蛋白进行荧光标记[而四嗪与环丙烯之间的加成反映（图13（c））也被应用于对活细胞中的蛋白进行荧光标记和分析[

以上叙述的生物正交反映均必需通过各类化学官能团之间的彼此作用才能实现,而这些官能团的生物正交性是保证这些化学反映在生物体内正交进行的基础,也就是要求这些化学官能团必需和生物

图11无铜点击化学反映

图12施陶丁格反映示用意

图13四嗪与双键间的狄尔斯-阿尔德反映

体内已经天然存在的各类反映基团互不干扰.这种官能团常常需要生物体通过非天然的方式从体外取得,并特异表达于生物大分子中.因此,在进展生物正交反映时,如何有效而特异地将正交性官能团引入活体细胞,并安装在生物大分子特定位点上,是这一领域向前进展所面临的一个重要难题.

与此同时,由斯坦福大学RaoJ课题组[开发的结尾半胱氨酸与氰基间的缩合反映也被成功用于化学生物学领域当中（图14）.这一反映利用天然氨基酸进行,而且反映温和、迅速,因此具有专门好的生物兼容性,是一种理想的生物正交反映.这