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浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文
浙江工业大学生物与环境工程学院
生物化学实验论文
姓名:
组员:
学号:
学科:
食品科学与工程
所在院系:
生物与环境工程学院
*******
2012年12月1日填
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
摘要:
为了解酶的初步提取及纯化方法,并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法;用Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法,SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量。
除此之外,还要掌握高速离心机、Q-Sepharose柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。
这一系列实验需要实验预制作——酵母的自溶,大约3天以后,酵母细胞壁破裂,胞液流出,经多次分别离心得到初提液A、热提液B和乙醇提取液C。
利用Q-Sepharose柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液D并在280nm处测D的吸光值,用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试,发现洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高,从第3管以后吸光值开始下降,且吸光值大的酶活力较大。
得到4种酶提取液样品以后,便可以制作葡萄糖标准曲线,进行定量酶活力测定,葡萄糖标准曲线是一条直线,根据曲线回归方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率,比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。
随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量,与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较,后者测出的总蛋白含量比前者大,并且知道随着酶的提纯,A、B、C、D4个样品的纯化系数升高,比活力升高,总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降,其中A的蛋白质含量最高,D的纯化程度最高。
最后用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量,得到2条蔗糖酶条带,计算的蔗糖酶相对分子质量。
关键词:
蔗糖酶;提取纯化;酶活力测定;Folin-酚试剂;微量凯式定氮法;SDS-聚丙烯胺凝胶
Summary:
Tounderstandthetheenzymespreliminaryextractionandpurificationmethods,andonthisbasistomastertheprinciplesandmethodsofdeterminationofenzymeactivity;Folin-phenolreagent,traceKayceremonywillbetheprinciplesandmethodsofnitrogendeterminationoftheproteincontent,SDS-PAGEproteindeterminationoftherelativemolecularmass.Inaddition,wemustmastertheuseofhigh-speedcentrifuges,Q-Sepharosecolumnchromatography,UVspectrophotometer,Kjeldahlinstrument,distillationapparatus,electrophoresis.
Thisseriesofexperimentsrequiresexperimentalpre-production-yeastautolysis,aboutthreedayslater,theyeastcellwallrupture,cytosolicoutflowtothebeginningofextractsA,afterrepeatedlyrespectivelycentrifugalheatextractsBandethanolextractC.UsingQ-SepharosecolumnchromatographytoobtainaneluateDelutedethanolextractCandtheabsorbancevalueofthe280nmmeasuredatD,theenzymeactivitytest,andfoundtopenetratewashpeakobtainedwithglucosetestsstripsqualitative1,2tubeenzymeactivitybegantodecreasefromtheabsorbancevaluesafter3andsuckthelightvaluegreaterenzymeactivity.Latertoobtainfourkindsofenzymeextractionfluidsample,itcanproduceastandardcurveofglucose,quantitativeenzymeactivityassay,theglucosestandardcurveisastraightline,accordingtotheregressionequationtocalculatethenumberofunitsandenzymerecoveryofthetotalactivityofthefoursamples,andcomparingthecalculatedresultsYoucanknowarereducedasthenumberofunitsofthetotalactivityofthepurifiedenzymesucrasecontinuesandenzymerecoveries.FollowedbytheproteincontentinthemeasuredsamplesoftheFolin-phenolreagentmethod,microKjeldahlnitrogenmethodresultswerecompared,whichmeasuredthetotalproteincontentthantheformer,andknowwiththepurificationoftheenzyme,A,B,C,D4samplespurifiedcoefficientincreases,increasedspecificactivity,thetotalenzymeactivity,totalproteinandproteinrecoveryisonthedecline,whereinAisthehighestproteincontent,D,thehighestdegreeofpurification.SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisgelsamplescreeningseparationtestbrilliantbluestaining,elutionstepmeasurementofproteinmoleculesanddyemigrationdistanceIndirectdeterminationoftherelativemolecularmassofsucrasegettwothesucrasestripsucraserelativemolecularmass,thecalculated
Keywords:
sucrase;extractionandpurification;enzymeactivityassay;Folin-phenolreagent;micro-Kjeldahlmethod;SDS-polyacrylamidegel
正文:
1、文献综述
1.1
蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶(Invertase),可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖[1]。
随着分子生物学的发展,不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究,越来越需要纯度高的酶制剂。
由于酶本身也是蛋白质,因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同,一般来说,没有一种固定的方法,而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段:
①材料的选择与预处理;②细胞破碎;③抽提;④纯化;⑤浓缩﹑干燥及保存。
2、实验原理、材料和方法
2.1蔗糖酶的提取及初步提纯
2.1.1实验原理
酵母中含有蔗糖酶,而蔗糖酶属于胞内酶,所以常将细胞壁破碎后进行提取。
酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法,细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等,本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。
经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取,使蔗糖酶得到初步的提纯。
2.1.2试剂与器材
2.1.2.1试剂
①新鲜的啤酒酵母(冰冻在冰箱内,由实验室从啤酒厂买来);
②醋酸钠(AR);
③甲苯(AR);
④4mol/L醋酸;
⑤95%乙醇(<-20℃);
⑥0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。
称取121.1gTris溶于1500ml的蒸馏水中,用4mol/LHCl调节pH至7.3(HCl量约为230ml),用蒸馏水稀释到2L,即为0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。
⑦0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液:
将0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液稀释10倍即得。
注:
整个实验要注意避免高温,以防止酶失活。
2.1.2.2器材
①锥形瓶250ml(×1),50ml(×1);
②量筒10ml(×1)25ml(×1);
③烧杯100ml(×1),1000ml(×1);
④具塞试管10ml(×3);
⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸;
⑥培养箱;
⑦恒温水浴箱;
⑧磁力搅拌器,搅拌子;
⑨高速冷冻离心机。
2.1.3操作方法
1.酵母的自溶:
培养60小时
2.初提取液A
在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶,经操作取上层液体记体积为VA=14.8ml。
3.热提取液B:
VB=13.0ml。
4.乙醇沉淀提取液C
将热提取液B倒入100ml小烧杯中,将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加98%的冰乙醇,30min后继续搅拌5min,离心,平衡(用50%的乙醇,对方加),用0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体,与离心管中固体一起再次离心,得Vc=5.0ml。
2.1.4结果与分析
2.1.4.1结果
表2-1
提取液
颜色状态
体积(ml)
分析评价
A
棕黄色液体
25.62
过大
B
橙黄色液体
24.00
C
淡黄色液体
6.10
过小
VA总=VA=25.62ml
VB总=VB·[VA/(VA-3)]=24.0ml
VC总=Vc·[VA/(VA-3)]·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=6.1ml
2.1.4.2分析
在这次试验中,数据为初始数据,实验结果的真实可靠是以后实验的保障。
我们的数据在A的时候偏大,C偏小,可能是因为我们离心过程的操作不是很正确,但是这不会影响到后续实验。
2.1.4.3结论
VA总=25.62ml;VB总=24.0ml;VC总=6.1ml。
2.1.5注意事项
①第一次离心后取液体时要小心。
重新离心后倒出液体留下固体。
②水浴时的温度不要超过50℃。
同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。
冰浴时要迅速操作。
③冰浴操作过程中加缓冲液使固体充分溶解,减少损失。
2.2蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法
2.2.1实验原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以一定pH和离子强度的溶液为流动相,流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应,利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异,而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。
由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同,它们被吸引的程度也不同。
当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时,降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来,用含阴离子(如Cl-)的溶液洗柱,含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来,增加Cl-浓度,含电荷多的蛋白质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。
2.2.2试剂与器材
2.2.2.1试剂
①0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液;
②1mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液;
③0.5mol/LNaOH;
④QSepharose,长期保存需置于20%乙醇中,4℃保存。
注:
整个实验要注意避免高温,以防止酶失活。
2.2.2.2器材
①层析柱;
②梯度混合器;
③磁力搅拌器,搅拌子;
④紫外分光光度计;
⑤点滴板;
⑥尿糖试纸、擦镜纸;
⑦止水夹;
⑧烧杯、试管。
2.2.3操作方法
1.离子交换柱的填充
将层析柱垂直固定,加水,排除气泡,再加少量水,装入离子交换剂,至柱高5cm,交换柱上端保留少许水(不得干柱)。
2.缓冲液盐度梯度发生器的安装
在低浓度一段装入搅拌子。
且要形成梯度。
3.柱的平衡
将柱子与恒流泵连通,用25mlTris-HClpH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后,交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4.加样
缓慢加样,不能把柱面冲到导致柱面不平,这是实验成功的关键之一
5.洗脱
为防止液面低于交换剂表面,加入了5ml缓冲液。
6.测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下:
表2-2
试管号
OD值
试管号
OD值
1
0.630
13
0.528
2
0.237
14
0.551
3
0.145
15
0.198
4
0.165
16
0.094
5
0.121
17
0.174
6
0.114
18
0.174
7
0.066
19
0.099
8
0.049
20
0.041
9
0.082
21
0.051
10
0.169
22
0.006
11
0.350
23
0.012
12
0.431
7.酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小,由以上OD值,取13、14、19管进行测试。
酶活力测试方法:
在点滴板中滴2滴5%蔗糖,再加2滴待测洗脱液,用玻璃棒搅匀,放置5min,浸入葡萄糖试纸,1s后取出,60s比较颜色深浅。
将其合并成一管,VD=5.6ml
2.2.4结果与分析
2.2.4.1结果
VD=5.6ml
VD总=VD·VC总/V样=5.6×6.1/0.5=68.32ml。
由数据得表如下:
图2-1QSepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.2.4.2分析
先用25mlTris-HCl洗穿透锋,得到8只试管。
但是如果在用量筒接的时候每管不是3ml,那么也许就没有8只了,这是实验的大忌。
会造成很大的误差,用梯度洗脱时,测得的OD值会成波动形式,而不是直线上升或者直线下降。
如果上提取液c中的酶浓度不够高,也可能导致提纯酶浓度不够高,以后在检验活力的时候会发现D根本就没有酶活力,于是实验重做,我们在做这个实验的时候应该想到各种情况带来的实验误差。
在收集D时,我们不小心到出了些,考虑到可能不够用,所以多取了一试管的D液。
在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAESepharose层析方法,但比较这几种方法,用Q-Sepharose纯化方法有如下特点:
(1)提高实验效果。
琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。
蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
(2)缩短实验时间。
梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。
(3)节约实验支出。
离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。
琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。
且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.2.4.3结论
VD5.6ml
VD总=68.32ml。
2.2.5注意
①在整个柱操作过程中,要严格防止液面低于交换剂的表面。
当液面低于交换剂表面时,空气进入交换剂内,形成气泡,而影响分离效果。
②加样不可太快,以免搅浑交换剂的表面,而使分离不纯。
③恒流泵的流速要控制好,要速度有利于液体滴下来,同时防止液体下滴过快而引起干柱。
是绝对不能干柱。
2.3蔗糖酶活力的测定
2.3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量,进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖,可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应,生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。
在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系,于是做出葡萄糖标准曲线以后,就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力,通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数(U):
在一定条件下,3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量,称为1个活力单位数。
总活力单位数=(V测体积测出的葡萄糖克数/V测)*(试管溶液总体积/2)*V总*n
V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=(各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活)*100%
2.3.2试剂与器材
2.3.2.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
(1)甲液:
溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
(2)乙液:
称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中,再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液(0.2mg/ml)准确称取20mg分析纯葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解后,定量移入100ml的容量瓶中,定容。
5%蔗糖、;
③0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中,加近260ml的1mol/L醋酸调pH到4.6,稀释至2L;
15%蔗糖用0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液配置;
22mol/LNaOH溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
2.3.2.2器材
①电炉;
②恒温水浴;
③紫外分光光度计;
④试管、吸管;
2.3.3操作方法
1.葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管,分别按表3-1加入各种试剂。
将各管内液体混合均匀,在沸水浴加热5min。
取出后立即用冷水冷却到室温,于540nm波长处测OD值,以葡萄糖的毫克数为横坐标,OD值为纵坐标,画出标准曲线。
表2-3葡萄糖标准曲线的制作
试管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖
0.0
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
蒸馏水
3.0
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
DNS
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
总体积
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
OD
0.000
0.121
0.236
0.359
0.482
0.599
2.酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释:
初提取液A(1:
200);热提取液B(1:
200);乙醇提取液C(1:
200);柱分离液D(1:
20)。
②取8支试管,按表3-2加入各种试剂。
表2-4酶的催化反应
项目
A(1:
200)
B(1:
200)
C(1:
200)
D(1:
20)
加样
A对
A样
B对
B样
C对
C样
D对
D样
酶液/ml
2
2
2
2
2
2
2
2
2NNaOH
0.5
—
0.5
—
0.5
—
0.5
—
35℃预热10min,同时预热5%蔗糖
5%蔗糖
2
2
2
2
2
2
2
2
立即摇匀,准确计时,反应3min
2NNaOH
—
0.5
—
0.5
—
0.5
—
0.5
总体积/ml
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
③取反应液A0.25ml,B0.25ml,C0.20ml,D0.3ml进行DNS反应,测定540nm处OD值。
得到ODA=0.193ODB=0.161ODC=0.306ODD=0.284
2.3.4结果与分析
2.3.4.1结果
①绘制葡萄糖标准曲线
图2-2
总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n
酶的回收率=(各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活)·100%
本次试验最终结果:
表2-5
项目
初提液A
热提取液B
乙醇提取液C
柱分离液D
V测/ml
0.25
0.25
0.2
0.3
mg
0.185
0.174
0.222
0.215
V总/ml
25.62
24
6.1
68.32
总活力单位数/U
8531.46
7516.8
3046.95
2203.32
回收率/%
100
88.1
35.7
25.8
2.3.4.2分析
本次实验基本还算成功,葡萄糖标准曲线的线性较好,乙醇提取液C的回收率较低,可能实验操作带来的误差。
本次试验的计算公式有严格的要求,经过反复演算方才能得出实验结果。
实验公式可以改为:
总活力单位数=mg/V测*4.5/V配*V总/V取
其中,V取表示稀释时的取样数
V配表示稀释后的毫升数
这是第一次用办公软件处理数据,感到很新鲜,也意识到计算机在科学研究中的重要性。
2.3.5注意
①做葡萄糖标准曲线时,加完各种试剂后要充分摇匀。
要求测得的OD值在0.1~0.7
②测定酶活力时,要准确反应3min,这个反应时间应该精确把握,不要多1秒也不要少1秒
③测得在线性范围外的OD值,需重新配液显色反应
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