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羊肚菌液体菌种培养技术初探
羊肚菌液体菌种培养技术初探
摘要:
近年来,我国已进行了羊肚菌培养的研究,但通常是采用固体培养法,对其菌丝球液体培养的研究尚不多见。
为此,我们进行了羊肚菌液体菌种培养基配方的研究,以期为羊肚菌菌种的生产提供新的途径。
以常规无菌操作技术,将玉米粒大小的菌块接入已灭菌的待用液体培养基中,于24℃静置24h后移至摇床培养箱内震荡培养。
对羊肚菌菌丝体液体培养条件的研究表明:
当温度为25℃,摇床转速为100r/min,三角瓶装量为100mL,培养液pH为7.0,可以明显地提高菌丝体的生物量;对羊肚菌进行液体摇瓶培养,以菌丝生物量、菌丝球的大小及个数为筛选指标,通过单因素方差分析,确定了羊肚菌菌丝体生长的最佳液体培养基配方为:
马铃薯200g,KH2PO42g,MgSO40.6g,VB10.5mg,葡萄糖20g,乳酸3g,酵母膏1g,水1000mL,
pH7.0。
关键词:
羊肚菌;摇瓶培养;液体培养基
ThetechniqueexplorationtocultivatingtheliquidcultureofMorchella
conica
Abstract:
Inrecentyears,ChinahaslaunchedacultureofMorchellaconica,buttheyareusuallyinsolidculture,liquidculturemyceliumoftheirresearchisstillrare.SoinordertoprovidefortheproductionofnewstrainsofMorchellaconicabasis,wehavehadaresearchaboutamorelliquidformulationofculturedbacteria,Byaseptictechnique,putasizeofthecornfungusblockaccessintothestand-sterilizedliquidmedium,andafterstanding24hat24℃inshakingshakingmove.OnliquidcultureofMyceliumresearchshowsthat:
Whenthetemperatureis25℃,rotationspeedis100r/min,flaskvolumeof100mL,pH7.0medium,whichcansignificantlyincreasethebiomassofmycelium.culturetheMorchellaconicainliquidshakeflaskagain,choosingbythemycelialbiomass,pelletsizeandthenumberofindicators,andanalysissinglefactorofvariance,wecandeterminetheoptimalgrowthofMyceliuminliquidmedium,andthecomposition:
potatoes200g,KH2PO42g,MgSO40.6g,VB10.5mg,glucose20g,lacticacid3g,yeastextract1g,water1000mL,pH7.0.
Keywords:
Morchellaconica;Flaskculture;Liquidmedium
羊肚菌(Morchellaconica)又名美味羊肚菌,俗称羊雀菌、包谷菌等,隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)。
据报道,全球羊肚菌属共有30多个种,分布于亚洲、欧洲、北美洲及大洋洲的一些地区,所以羊肚菌的分布是世界性的。
羊肚菌多分布在公路边、河边、山坡、峡谷、火烧林、阔叶林或针阔混交林的腐殖质层土上。
生长的土壤类型有黑壤土、山地灰褐森林土、沙壤土、黄壤土等[6]。
羊肚菌子实体的生长季节在每年的3~5月和8~9月,气温达10~20℃,地表温度达12~24℃,月降雨量一般35~60mm[2-3]。
所以,羊肚菌是在低温、高湿条件下萌发子实体的[1]。
羊肚菌的菌丝体呈白色,有分隔,分隔处有缢缩,隔膜上有孔洞,多核,无锁状联合,异宗接合,常产生菌核(一种坚硬的、无性细胞团,是羊肚菌的营养贮藏器官,在休眠阶段可使其渡过不良的气候条件),尚未发现有分生孢子或其他无性孢子出现[14]。
羊肚菌子实体的菌盖近球形或圆锥形,边缘全部与柄相连,表面起伏成蜂窝状网棱纹,因其形状像羊肚而被称为羊肚菌。
菌柄内部空心,外面平整或有凹槽,颜色从灰白到深褐色[15-17]。
子囊呈圆柱形,每个子囊含8个子囊孢子,单行排列子囊之间有长的侧丝,子囊孢子呈卵圆形[2,7-9]。
羊肚菌是一种珍稀的野生食用菌,也是一种高级营养滋补品。
羊肚菌在国际市场上供不应求,价格一直居高不下。
早在60~70年代,欧美各国就通过发酵生产菌丝体作为调味品投放市场[11]。
近年来,细胞外代谢产物的研究[11-12],发酵制品提高免疫功能及抗肿瘤功能的研究[4],是液体培养成为一个重要的研究方向。
本实验从羊肚菌的液体培养条件和培养基着手,筛选出最佳液体培养条件和最优摇瓶培养基,目的是能够进一步有效的研究和开发利用这一珍贵的真菌资源。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种及来源
羊肚菌(Morchellaconica),试管母种购于华中农大微生物实验室。
1.1.2仪器及型号
北京产电子天平BS2202S,自动电热蒸汽灭菌器LDZX-40AZ,净化工作台SW-CJ-LFD,上海产电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A,HNY-恒温培养振荡器等。
1.1.3培养基
①配方一:
马铃薯200g,葡萄糖20g,KH2PO42g,MgSO40.6g,VB10.5mg,酵母膏1g,乳酸3g,水1000mL,pH7.0。
②配方二:
葡萄糖20g,KNO32g,KH2PO40.5g,MgSO40.5g,NaCl0.5g,水1000mL,pH7.0。
③配方三:
马铃薯200g,蔗糖20g,KH2PO41g,MgSO40.5g,蛋白胨2g,酵母膏1g,水1000mL,pH7.0。
④配方四:
马铃薯200g,葡萄糖50g,KH2PO43g,MgSO41.5g,VB110mg,水1000mL,pH7.0。
⑤配方五:
玉米粉20g,蛋白胨1g,葡萄糖20g,K2HPO41g,MgSO40.5g,水1000mL,pH7.0。
⑥配方六:
胡萝卜200g,黄豆粉20g,蔗糖20g,K2HPO41g,MgSO41g,VB11mg,水1000mL,pH7.0。
⑦PDA液体培养基配方:
马铃薯200g,蔗糖15g,水1000mL,pH自然。
1.2实验方法
1.2.1培养基制备
按以上七种配方分别制备培养基,配方中有马铃薯者,将马铃薯去皮切块(0.51cm)称重,置沸水中煮25min,用四层纱布过滤挤压取其汁液置于烧杯中,同时加入其他药品搅拌使其充分溶解,加水定容至1000mL,测定并调整酸碱度,将制备好的培养基分别装入250mL三角瓶中,封口,在1.141.05Pa的压强120℃下高压灭菌30min后,待高压锅中的气压降至0,取出三角瓶冷却后置于无菌接种箱中备用[19]。
1.2.2液体培养条件的筛选
在250mL三角瓶中,按常规无菌操作技术分别装入80、90、100、110、120mL容量的PDA培养基;分别加入玻璃珠5、10、15、20、25粒;分别将pH调至6、6.5、7、7.5、8的条件下分3组进行试验,按常规无菌操作技术每瓶接入等量3个玉米粒大小试管母种于菌液中静置24h,然后移至振荡培养箱中,在25℃、100r/min振荡培养至终点菌丝为止。
1.2.3摇瓶培养基的筛选
在液体培养条件的筛选基础上,在250mL三角瓶中,每配方分别装入100mL培养基、10粒玻璃珠,pH用NaOH或HCl溶液调至7.0,按常规无菌操作技术每瓶接入等量3个玉米粒大小试管母种于菌液中静置24h,然后移至振荡培养箱中,在25℃、100r/min振荡培养至终点菌丝为止。
1.3测定指标与方法
1.3.1菌丝生物量的测定
取出摇瓶终点菌丝(菌球表面出现粗糙、有絮状时),去掉接种进去的菌块,过滤后用无菌水冲洗3次。
60℃烘干称重,重复3次取其平均值。
1.3.2菌丝球数量的测定
将上述各配方液体培养基菌悬液震荡摇匀,分别取10mL静置后数菌球数,重复三次,取其平均值。
1.3.3菌丝球直径测定
将六种配方菌液摇匀,分别取10mL倒入培养皿中,静置后,皿底垫坐标纸,将菌球用解剖针拨动排成直线,量取直线长度,算出菌球直径。
2实验结果及分析
2.1羊肚菌液体培养条件
2.1.1培养基容量对菌丝生长的影响
实验结果表明(图一):
培养基容量在100mL以下,随着培养基容量的增加,生物量也增加。
装入100mL培养基时,生物量为1.10g。
但装得过多,生物量不会成比例增加。
装入120mL培养基,生物量仅为0.99g。
比装100mL培养基时下降10%。
以100mL/250mL三角瓶为最适宜,生物量最高。
2.1.2玻璃珠数量对菌丝生长量的影响
文献报道[7],添加不同数量的玻璃珠可以提高某些担子菌的生物量,并能改变菌丝球的大小。
但是本实验结果未能说明各处理存在明显的差异。
2.1.3酸碱度对菌丝生长的影响
实验结果表明(图二),pH7.0时,生物量为0.96g;pH8.0时,生物量为0.65g。
pH6.0时,生物量为0.53g。
在pH6.5~7.5范围内,菌丝生长较好,生物量比较高。
pH超过7.5或者低于6.5,生物量下降,因此,最适pH为7.0。
2.2摇瓶培养基的筛选
2.2.1羊肚菌在六种配方的摇瓶培养基上的生物量
表1羊肚菌在六种配方的摇瓶培养基上的生物量(g/100mL)
重复
配方
A1
A2
A3
A4
A5
A6
1
0.872
0.003
0.011
0.138
0.785
0.201
2
0.931
0.008
0.048
0.415
0.641
0.981
3
1.320
0.015
0.021
0.317
0.576
0.675
4
1.303
0.031
0.025
0.322
0.732
0.559
5
1.025
0.018
0.033
0.257
0.728
0.480
总和
5.451
0.075
0.138
1.449
3.462
2.896
T6=13.471
平均数
1.090
0.015
0.028
0.289
2.425
0.579
2.693
表2羊肚菌在六种配方的摇瓶培养基上的生物量的方差分析
配方
平均数
(Xi)
差异显著性
Xi-0.015
Xi-0.028
Xi-0.289
Xi-0.579
Xi-0.692
A1
A5
A6
A4
A3
A2
1.090
0.692
0.579
0.289
0.028
0.015
1.075**
0.677**
0.564**
0.274*
0.013
1.062**
0.664**
0.551**
0.261*
0.801**
0.403**
0.290**
0.511**
0.113
0.398**
LSD0..05=2.0640.098=0.202LSD0.01=2.7970.098=0.274
**表示差异极显著,*表示差异显著
羊肚菌在六种配方的摇瓶培养基上的生物量的测定结果见表1,从表1中可以看出羊肚菌在配方一的摇瓶培养基上的生物量最大。
对其进行方差分析,结果见表2。
检验结果表明:
羊肚菌在不同的摇瓶培养基上的生物量各不相同,在配方一的培养基上生物量达到最大,为1.09g,与配方二、三、四、五、六培养基上的生物量达到极显著差异。
配方二、三的培养基上的生物量最小,其差异不显著。
2.2.2不同培养基配方菌丝球数量及大小结果见表3。
培养基配方
菌丝球个数(个/100mL)
菌丝球大小(mm)
①
49
15-18
②
12
8-17
③
16
10-25
④
18
10-25
⑤
31
13-16
⑥
23
13-15
实验结果表明,六种培养基都可形成菌丝球,但菌丝球大小及个数不均一,培养基①⑤⑥形成的菌丝球较大,直径分别为15~18mm、13~16mm和13~15mm。
六种培养基的菌丝球个数以①⑤⑥培养基的较多,其中①培养基的最多,菌丝球数量为49个/100mL。
综合上述,羊肚菌液体菌种最佳培养基为配方一,其组成为:
马铃薯200g,葡萄糖20g,KH2PO42g,MgSO40.6g,VB10.5mg,酵母膏1g,乳酸3g,水1000mL,pH7.0。
培养后菌丝球个数最多,为49个/100mL,菌丝球大小为15~18mm,生物量为1.090g/100mL。
3讨论
羊肚菌是一种珍稀食药用真菌,营养丰富,含有多种抗病毒、抗肿瘤等作用的生理活性物质,在食品、保健品、医药化妆品等领域有着广阔的应用前景。
在20世纪60年代,美法等国家利用羊肚菌菌丝体制造出调味品[13,18];日本利用其菌丝体提取黑色素抑制剂,开发了具有美白效果的化妆品;我国在开发羊肚菌保健方面有较大进展。
本实验进行了羊肚菌液体培养最优配方和生长条件的筛选,对羊肚菌开发应用具有重要的意义,有关羊肚菌液体菌种培养所需营养物质还需进一步深入研究[20]。
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