细胞免疫组化.docx
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细胞免疫组化
细胞免疫组化
细胞爬片的免疫组化
1.细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色定。
2.PBS清洗标本3次各1min。
3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。
4.空气干燥5min。
5.PBS清洗标本3次各2min。
6.0.5%TritonX-100(DPBS配)孵育1次20min。
7.PBS清洗标本3次各2min。
8.3%H2O2(试剂A)孵育15min。
9.DPBS清洗标本3次各2min。
10.封闭血清孵育(试剂B)20min。
11.一抗孵育(滴度1:
200,湿盒)4℃过夜或37℃60min。
阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液
12.PBS清洗标本3次各5min。
13.二抗工作液孵育(湿盒试剂C)37℃30min。
14.PBS清洗标本3次各5min。
15.试剂D(湿盒)37℃30min。
16、PBS清洗标本3次各5min。
17、DAB显色(避光,镜下观察至棕色)约3~10min。
18、蒸馏水洗2次1min。
19、苏木素复染0.5~1min。
20、自来水洗返蓝。
21.梯度酒精脱水75,85,95,100%各3min。
22.二甲苯透明2次3min。
23、中性树胶封片。
注意事项:
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意以下:
a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片;
b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜,若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片)
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、TritonX-100表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做?
1.如果不看荧光,两种都可以,感觉粘好了再做要快一些,但是做的时候要防止脱落。
如果看荧光,就不能用中性树胶粘,直接在24孔,或6孔板里做才可以。
中性树胶要折光,散射的光干扰,没办法看细胞本身的荧光。
2.孔板里做免疫组化较方便,细胞比盖玻片易贴壁,但染色后不能用二甲苯透明、封片(可用甘油)。
细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能,只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。
3.我没有在多孔板里做过,其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦,偶这样做很少掉片。
先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上,由于液体的表面张力,细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面,等细胞大概贴壁后,不同细胞贴壁时间稍有不同,大概6、7个小时,差不多贴壁再加生长液,开始滴的细胞的数量你要摸索一下,到固定时细胞生长到80%左右比较合适。
偶是在盖玻片上做的,首先细胞要爬的匀一些,象dongwp战友的就很好。
然后倾去生长液冲洗、固定之后,用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。
擦干盖玻片的背面,在玻片背面四周涂一点凡士林,粘贴于载玻片上,这一点很重要,在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。
细胞爬片的保存和抗原修复问题总结
1.细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!
!
加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。
但是我建议对于细胞爬片,还是尽量快的进行处理,以防不必要的问题!
2.louischenwrote:
但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定,PBS冲洗后直接就放在了-20度,还能用于免疫组化吗?
!
应该没有问题,但是还是现作先染好些,以防抗原的丢失
3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。
其它建议用甲醇固定。
-20度保存
4.如果是4%多聚甲醛固定,然后放在PBS中保存,在4度冰箱里保存两周没问题。
时间再长就没试过了。
5.丙酮中固定5-10分钟,然后风干,放置4度保存过夜应该是没有问题。
不要固定过夜,蛋白质固定过度,会影响抗原的暴露,影响免疫组化结果。
如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果,可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟,渗透细胞膜。
如果玻片没有经过特殊处理,不要用其他抗原修复的方法,会造成掉片,我曾有过这方面的体会
6.丙酮固定后,PBS洗涤3次,即可保存至4度冰箱备用。
7.
(1)细胞爬片先用TBS洗3次,每次5分钟
(2)4%多聚甲醛固定,室温,20分钟
(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水,通风橱内干燥,-80度保存。
2周没有问题的,我保存过2个月都有信号,不过还是保存时间短一点的好
8.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好
9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定,用PBS冲洗后,晾干,放在-20度保存一个月没有问题的。
10.细胞爬片,有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后,轻轻摇动玻片或培养皿等,静置2min左右,弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气干燥,干燥后的标本可于-70℃长期保存。
解冻时要小心抗原破坏,应先将标本转移于干冰预冷的固定液,然后再将混合液转移至室温下,固定液到达室温时取出标本,再用PBS冲洗,在做以后的步鄹
11.我也做过细胞爬片的组化染色,不过没有遇到类似的问题。
细胞培养好后用PBS洗一遍,然后4%多聚甲醛4度固定15分钟,自然风干。
室温保存几周内都可以用的。
我想这可能与抗原的类型有关,有的对氧化等损伤比较敏感,有的差一些。
最好避光保存在4度,同时尽量隔绝空气。
免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记,样品的保存应该是没有多大差别的。
12.细胞爬片丙酮固定后-20度保存,现在要再做免疫荧光,将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了
14.4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以,也有用无水酒精的,固定好后放-20度,2-3个月是没有问题的。
15.对于一般的细胞免疫组化,我的做法是:
细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN,再在通风柜将丙酮吹干,—-20度保存,用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖,穿透性很强,保存抗原的免疫活性好。
所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。
当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。
如:
1.多聚甲醛(常用4%):
可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
2.乙醇。
优点:
穿透性强、抗原性保存较好。
缺点:
但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度
3.甲醛(福尔马林)应用最广优点:
形态结构保存好,且穿透性强,缺点:
甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
16.4度是不能保存这么长时间(1个月)的,如果抗原已被分解,再修复也没用!
17.弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气干燥,干燥后的标本可于-70℃长期保存。
18.爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用。
19.固定后放点PBS,然后放在4度冰箱中保存,我最长保存两个月的,然后再做免疫组化,应该没有太大的问题的。
20.固定后4度可以存放一周,-20度存放半年,我现在也要做这个,实验室老师教的。
21.四度放1周应该没问题的,你最好放在-20度,我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多,不可能一次作完,一个月没问题.
22.最佳的固定及保存方法:
(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH):
福尔马林(40%甲醛,用时加入过量碱式MgCO3中和)10.0ml
Na2HPO4.12H2o1.9653g
NaH2PO4.2H2O0.5460g
加0.85%NaCl溶液溶解,定容至100ml。
(2)细胞固定:
待细胞接近长成单层时,用镊子取出盖玻片,迅速于37℃PBS中漂洗2次,每次3-5秒,以清除血清。
(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。
(4)用镊子取出盖玻片,PBS漂洗2次,每次3-5秒,晾干保存于-20℃备用。
可长期保存,做实验时,取出片子,入PBS湿润后即可进行你的实验。
可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。
(本帖没有加分)
23.细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.
24.skywalkerzzwrote:
过氧化氢处理这一步,用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢,然后室温下玻片放在其中浸泡10min,是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?
爬片应该用甲醇/双氧水,你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片
25.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛,20分钟很好用的。
保存的时候注意片子最好晾干,不要挤压,防止粘片和碎裂。
26.细胞爬片固定好以后,如果要保存,我们的做法是倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度,最长半年没问题。
27.1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15min,PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了
2、爬片PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否能保存,怎样保存?
1、洗过就可以做免疫组化了。
2、固定过后自然干燥,不要洗,-20度保存。
做之前再洗。
28.细胞固定最好用丙酮或酒精,不要用4%多聚甲醛,以免抗原交联,这样组化时不用再抗原修复。
细胞固定后可室温保存在丙酮中,不使之干燥。
29.如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,
30.适当密度后取出固定(丙酮-20固定10~20min),再进行免疫染色。
31.一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上,冷丙酮固定15-20分钟,然后放-20度,没有问题。
如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行,冷丙酮会腐蚀板子,最好4%多聚甲醛。
32.细胞爬片用纯丙酮固定10分钟,取出干燥后用锡纸包裹,-70度保存。
33.4%多聚甲醛固定后PBS水洗,自然干燥后用锡纸包裹,-20度冻存不超过1月。
34.如果细胞贴壁困难,可将片子先用纯血清挂一层,凉干后再养细胞。
35.可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片,商品名Thermanox™Coverslips。
高分子材料,耐高温灭菌,经过特殊表面处理,细胞容易贴附。
可以用剪刀任意裁剪,使用效果好。
上海生工有现货,不用国外定货。
我使用后,觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。
36.我们通常是把细胞玻片固定好后,用PBS冲洗干净,然后用酒精脱水(80%,90%,100%,100%酒精各一次,每次10分钟左右),然后放在烘箱里烘干,这是就相当于石蜡切片了,可以保存一定的时间。
这个方法我们试过的,保持一段时间后做,效果还是可以的。
免疫细胞化学染色操作规程
一、材料和
1、玻片:
须用免疫组化专用玻片,或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。
2、5-10%正常山羊血清封闭液,用PBS配。
3、3%牛血清白蛋白(BSA),用PBS配。
4、0.01MPH7.4PBS
5、1%BSA-PBS(含0.05%Tween20)
6、AEC底物
(1)底物缓冲液(20X)PH4.6
醋酸(分子量60.6)30.6ml
Triton-100
醋酸钠3H2O(分子量136.1)66.68克
加蒸馏水到960ml,调PH到4.6,最后加蒸馏水到总体积1000ml
(2)AEC(20X)
AEC15mg/ml,溶在DMF(二甲基甲酰胺,分子式HCOH(CH3)2分子量73.10中)
(3)0.6%H2O2(20X)
临用时,
(1)
(2)(3)各50ul,在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。
7、DAB(即DAB-4HCL)
(1)1.5克DAB在100ml水溶液中(20X)
(2)1MTris(20X),用HCL调PH到7.4
(1)
(2)(3)各滴加入1ml二蒸水中,新鲜配,避光,30分钟内有效。
溶解后(可加热到500C),加水合氯醛50克(水合氯醛ChloralHyclrate,分子量165.4),枸橼酸1克,充分溶解,于棕色瓶中,室温或40C保存。
8、苏木素复染液
苏木素1克
碘酸钠0.2克
钾矾50克
水1000ml
9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。
10、3%H2O2:
30%H2O21份,加9份双蒸水,临用时配。
11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板(见ICCprotocol04)
12、封片液:
1克明胶,溶于30ml350C水中,加入35ml甘油(或用甘油封片)和650mg石碳酸(先溶于0.6ml水中)。
二、细胞内源过氧化物酶阻断(使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断)
1、从冰箱取出细胞片或细胞板,置室温或370C10-15分钟,使恢复温度。
2、加3%H2O2,细胞片20ul/孔,培养板100ul/孔,使充分覆盖住细胞。
3、室温10分钟后,甩掉H2O2,用PBS轻轻淋洗2分钟。
用滤纸吸干细胞周围水份,96孔在滤水纸上扣干,但注意保持细胞湿润。
三、封闭
细胞片用5-10%正常山羊血清(20ml/孔),细胞板用2-5%BSA(PBS配制)100ul/孔,置370C孵育30分钟后甩掉封闭液,不洗。
四、免疫化学染色
1、分别加一抗和所有对照一抗,细胞法10-20ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分覆盖细胞。
37℃1小时或4℃冰箱过夜;
2、弃去一抗,如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后,浸于100mL含PBST洗杯,漂洗(最好在慢速摇床上)3-5分钟,转入第二杯PBS(1000ml),如上法漂洗3-5分钟。
擦干细胞片周围水分,96孔板则倒掉一抗后,每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉,在滤纸上扣干,但保持细胞湿润,反复3-4次;
3、加S.P(S.P法,即放大法)
(1)加已优选好的浓度的Biotin标记二抗,细胞片10ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分复盖细胞。
37℃温和孵育30分钟;
(2)按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干;
(3)加已优选好浓度的S.P,用量同“
(1)”,37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干;
4、间接法加二抗(不放大法)
方法同S.P法,但不用Biotin标记二抗,而改用HRP直接标记二抗。
并省略(3)步骤;
5、加底物显色
(1)、加足量的AEC显色液,充分覆盖细胞层,细胞玻片20ul/孔,板50ul/孔,置于37℃恒温箱孵育5-10分钟,一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间,以得到满意的结果(阳性对照显色程度为“+++”),用自来水即可终止反应;
(2)、复染:
苏木素染液(使用时间最好不超过两个月)加苏木素复染液1-2滴,1分钟左右,在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素,再浸于PBS中约30秒钟返蓝色,最后在蒸馏水中漂洗。
6、封片
洗后细胞片擦去周围水分,滴加1滴甘油—明胶封片液,加盖玻片,除去气泡,用指甲油或树胶封固玻片。
五、结果判断
KSHV阳性——诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红色,强度不一,未诱导BCBL-1阳性细胞(1-30%)
阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色(排除边缘效应)
MCMV/HVMV阳性——感染病毒的细胞有病灶反应,显红色,强度不一,未感染细胞不显红色(排除非特异性染色)
阴性——感染细胞和未感染细胞不显红色
注意:
1、一抗、二抗的稀释采用1%BSA/PBS,Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS
2、整个反应过程在湿盒中进行(细胞片)
3、洗涤时应使用染色缸(细胞片)六、说明
1、测血时一抗血清稀释度要求
项目KSHVMVMVHCMV其它
稀释度1:
50,1:
100,1:
2001:
50,1:
100,1:
2001:
100,1:
500,1:
10001:
100,1:
500,1:
1000
可融合标准1:
100阳性时1:
100阳性1:
500阳性1:
500阳性2、S.P法使用二抗的不同情况
项目MCMVHCMV其它
样品母、亚上清血清、母、亚上清血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清
一抗为IgG型,
Biotin标记二抗Biotin-AntimouseIgGF(ab`)2,SIGMA,CAT:
B6774
一抗为IgM型,
Biotin标记二抗Biotin-AntimouseIgGAM,ZYMED,CAT:
62-6440
稀释度1:
2003、间接法(不放大法)使用二抗的不同情况
项目MCMVKSHV
样品血清血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清
一抗为IgG型,
HRP标记二抗HRP-AntimouseIgGFc,1:
100,SIGMA,CAT:
A-0168
一抗为IgM型,
HRP标记二抗HRP-AntimousePOLYVALENT,1:
100,SIGMA,CAT:
A-0412
稀释度1:
1004、对照系统,必须要做的对照系统如下:
阳性对照:
标准一抗,阳性血清,阳性上清
阴性对照:
(1)阴性一抗对照:
小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液
(2)阴性抗原细胞对照:
未感染病毒的细胞,每个待测及对照均须做阴性细胞对照
空白对照:
不加一抗,用1%BSA替代
无关对照:
与本项目无的第一
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