直链淀粉支链淀粉测定试剂盒.docx

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直链淀粉支链淀粉测定试剂盒

直链淀粉/支链淀粉测定试剂盒

用于测定淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量

AMYL11/99

简介:

决定谷物淀粉最终的特殊用途取决于淀粉众多特性中的直链淀粉/支链淀粉比率，因此，对于淀粉加工企业，淀粉中直链淀粉含量是一项非常重要的指标。

测定谷物淀粉中的直链淀粉通常采用电位测定法、糊化染色法或旋光分析法，即通过测定碘与直链淀粉结合生成直链淀粉-碘复合物的方法来评估直链淀粉含量，然而由于支链淀粉-碘复合物在此过程中同样会形成，因此这些方法的准确性常遭到质疑。

利用非比色方法测定游离碘离子的减少和通过比色测定直链淀粉-碘复合物的方法会导致高估直链淀粉的含量，是用此方法可能出现的更多问题请参考Gibsonetal11。

目前，国际上普遍采用结果更加准确的利用伴刀豆凝集素A（ConA）沉降支链淀粉，然后测定直链淀粉含量的方法，在特定的温度、pH和离子强度下，ConA可以特定的连接含吡喃葡萄糖基[a-D-glucosepyranosyl]或吡喃甘露基[a-D-mannopyranosyl]的支链多聚糖，因此会优先于直链淀粉与支链淀粉形成沉淀复合物。

原理:

加入二甲基亚砜（DMSO）的淀粉样品通过加热被完全溶解，乙醇洗脱样品中的油脂，回收洗涤后的淀粉样品，并用醋酸/钠盐溶液溶解，加入ConA后支链淀粉被特异性的沉降，离心分离支链淀粉，保存于悬浮液中的直链淀粉被酶水解生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶测定葡萄糖的含量。

溶解于醋酸/钠盐溶液中的总淀粉同样可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶/过氧化物酶测定葡萄糖。

在510nm测定利用ConA沉降后悬浮液中GOPOD吸光度的比率变化来计算直链淀粉的浓度，同样道理可计算出总淀粉浓度。

此方法适用于所有的纯净淀粉样品和谷物面粉。

精确性:

对于纯净淀粉和~10%的谷物面粉，批内偏差<5%

试剂盒:

试剂盒内提供有足够50-100次试验用的试剂

1.分析方法

2.冻干ConA（200mg）

3.淀粉葡萄糖苷酶/真菌α-淀粉酶悬浮液

4.葡萄糖测定液

5.葡萄糖反应缓冲液

6.葡萄糖标准液

7.淀粉参考标样（含有特定的直链淀粉）

安全手册:

1.DMSO可通过皮肤吸收，对皮肤和眼睛具有刺激性，试验过程中，必须穿戴实验室操作服和眼镜，并避免溶液滴溅，如有条件可在通风橱中操作，或在空气流通的实验室进行试验，如有溅洒，用大量清水冲洗。

2.伴刀豆凝集素A具有毒性，应避免吸入、皮肤接触和摄食，操作时必须穿戴实验室操作服和眼镜。

制备酶：

（A）淀粉葡萄糖苷酶[2ml]+真菌α-淀粉酶

用20ml醋酸钠缓冲液（100mM,pH4.5）溶解，分装于5ml的聚丙烯试管中，-20°保存。

使用溶解后的酶进行试验。

制备试剂：

（A）ConA溶液（4.0mg/ml）

用50ml的ConA缓冲液（缓冲液3）溶解试剂盒中提供的ConA冻干粉（200mg），分装并在-20°保存。

（B）GOPOD试剂

用蒸馏水稀释全部的葡萄糖反应缓冲液到1L，使用稀释后的葡萄糖反应缓冲液稀释葡萄糖测定液。

缓冲液稀释后浓度：

葡萄糖氧化酶>12,000U/升

过氧化物酶>650U/升

4-氨基安替比林0.4mM

稳定性：

4°C保存，2-3个月或-20°C保存，12个月

葡萄糖标准溶液

葡萄糖标准溶液（100μg/0.1ml；保存于0.2%的苯甲酸中），室温保存>5年。

淀粉参考标样

瓶签上标注有直链淀粉含量

缓冲液（试剂盒中未提供）

1.醋酸钠缓冲液（100mM,pH4.5）

5.9ml冰醋酸（,1.05g/ml）加入900ml蒸馏水，用1MNaOH（4g/100ml）调节pH到4.5（大约需要30ml），然后加入叠氮化钠（0.2g）并补液至1L。

室温中保存。

注意：

叠氮化钠是一种有毒化学物质应妥善保存。

叠氮化钠是葡萄糖缓冲液稳定剂，稀释操作过程中必须带防护手套进行操作。

二甲基亚砜对皮肤具有刺激性，应谨慎使用。

2.浓缩ConA缓冲液（pH6.4,600mM）

无水醋酸钠（BDHCatNo:

10236）-------------------49.2g

氯化钠（BDHCat.No:

10241）-----------------------175.5g

CaCl2.2H2O（MallinckrodtCat.No:

4160）------------0.5g

MgCl2.6H2O（BDHCat.No:

10149）------------------0.7g

MnCl2.4H2O（AjaxCat.No:

307）---------------------0.7g

将上述试剂溶解于900ml蒸馏水中，滴加冰醋酸调节pH到6.4，用蒸馏水补液至1L，4°C保存。

注意：

调节pH时必须谨慎小心，如果该溶液的pH低于6.4，将会产生沉淀物，重新调节pH沉淀物不会再溶解，因此，必须重新配置新的溶液。

3.ConA缓冲液（工作液）:

使用当天，用100ml蒸馏水稀释30ml浓缩ConA缓冲液。

4.二甲基亚砜（DMSO）

分析纯试剂（BDHAnalarCat.No:

10323）

设备:

1.玻璃器具

-试管（圆底;16x120mm,15ml）

-容量瓶（25ml）

-螺口戴帽样品管（10ml）

2.离心机（2,000g）

3.微量移液器（50-1000μl）.

4.连续分配器

5.分析天平.

6.分光光度计510nm.

7.漩涡混合器

8.定时钟

9.沸水浴锅

10.微量离心机（14,000g）

11.控温水浴箱（40°C）

12.微量离心管（2.0ml）

注意事项

1、淀粉样品必须用乙醇进行处理以去除油脂，如果样品不能用乙醇处理，样品中的直链淀粉含量可能会被低估50%

实验步骤

A.淀粉前处理

1、准确称取淀粉和面粉样品20-25mg，加入到螺口试管中，记录样品重量（精确到0.1mg）。

注意：

每批试验必须包括参考标样

每第五个样品设定重复管

2、加入1ml的DMSO，用漩涡混合器低速的轻轻振荡，盖住试管帽在沸水中加热直到完全溶解（大约1分钟），确保没有凝胶块残留。

3、用漩涡混合器高速混合，再次将试管置于沸水浴锅中加热15分钟，并间断性的用漩涡混合器高速混合。

4、室温下放置大约5分钟，加入2ml乙醇（95%），漩涡混合器混合，并再次加入乙醇4ml，振荡，将形成淀粉沉淀物，静置试管15分钟（或过夜）。

5、离心5分钟（2,000g），弃去悬浮液，并用吸水纸吸干试管中的液体，确保去除所有的乙醇溶液。

6、加入2ml的DMSO，用漩涡混合器低速振荡，沸水浴锅中加热15分钟，并间断性的混合，以避免凝胶形成。

7、加入4ml稀释的的ConA缓冲液（工作液），混合均匀，然后转移到25ml的容量瓶中，并用ConA缓冲液反复冲洗试管并一同加入容量瓶中，用ConA缓冲液定溶至刻度线。

（此溶液为溶液1）

注意：

必须在60分钟之内对此溶液进行测定。

B.用ConA沉淀支链淀粉，并测定直链淀粉

1、取1ml溶液1到2.0ml的微量离心管中，加入0.50ml的ConA缓冲液（4mg/ml），盖紧试管，轻轻的反复颠倒混合，避免样品起泡。

2、在室温中静置1小时，20°C下离心10分钟（14,000g）。

3、转移1ml的上层液到15ml的离心管中，加入3ml的醋酸钠缓冲液（100mM;pH4.5），轻轻的盖住试管盖，在沸水中加热5分钟。

4、将试管置于40°C的水浴箱中孵育5分钟，加入0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶，并继续在40°C的水浴箱中孵育30分钟，2,000g下离心5分钟。

5、加入4ml的GOPOD试剂，在40°C下孵育20分钟，同时孵育空白对照和葡萄糖质控。

6、相对于空白对照在510nm下读取每个样品和葡萄糖质控的吸光度值。

注意：

空白对照：

1.0ml醋酸那缓冲液+4ml的GOPOD试剂，在40°C下孵育20分钟

葡萄糖质控：

0.1ml的葡萄糖标准液（1mg/ml）+0.9ml醋酸那缓冲液+4ml的GOPOD试剂，在40°C下孵育20分钟

C.测定总淀粉

1、取0.5ml溶液1，加入4ml的醋酸钠缓冲液（100mM;pH4.5）。

2、加入0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶，在40°C的水浴箱中孵育10分钟。

3、转移1.0ml（两份）到测定试管中，加入4ml的GOPOD试剂，在40°C下孵育20分钟，同时孵育空白对照和葡萄糖质控。

计算直链淀粉含量（%）

ConA悬浮液吸光度6.15100

直链淀粉,%=xx

总淀粉吸光度9.21

ConA悬浮液吸光度

=x66.8

总淀粉吸光度

注释：

6.15和9.2分别代表ConA和总淀粉在提取时的稀释系数

注意:

1、加入ConA缓冲液的样品（如：

在试验步骤A中的溶液1）中的直链淀粉有衰退和沉淀倾向，因此不能放置过长时间。

2、为了达到ConA沉淀支链淀粉的效果必须在室温中放置60分钟（步骤B1），但是不能超过120分钟，因为直链淀粉有衰退倾向。

3、利用乙醇可去除样品中可溶性的糖，因为可溶性的糖会干扰试验。

参考文献:

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1987E.Rice:

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