还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法.docx
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还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法
、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的
再分别求出样品中还原糖
双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,
和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,
利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还
原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计
算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
小麦面粉;精密pH试纸。
2.主要仪器
(1)具塞玻璃刻度试管:
20mLX11
大离心管:
5OmL<2
烧杯:
lOOmlXl
三角瓶:
lOOmlXl
容量瓶:
100mL<3
(6)
刻度吸管:
ImK1;2mL<<2;lOmKl
沸水浴
(1O)扭力天平
(11)分光光度计
3.试剂
(1)1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取8OC烘至恒重的分析纯葡萄糖1OOmg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移
到1OOmL容量瓶中,用蒸馏水定容至1OOmL混匀,4C冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂
将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液,加到5OOmL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再
加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1OOOmL贮于棕色瓶中备
用。
碘-碘化钾溶液:
称取5g碘和1Og碘化钾,溶于1OOmL蒸馏水中。
酚酞指示剂:
称取O.1g酚酞,溶于25OmL7O3乙醇中。
6MHCl和6MNaOH各1OOmL。
四、操作步骤
1.制作葡萄糖标准曲线
取7支2OmL具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水
和3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
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表1葡萄糖标准曲线制作
2.样品中还原糖和总糖的测定
(1)还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉,放入100mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL
蒸馏水,搅匀,置于50C恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。
将浸出液(含沉淀)转移
到50mL离心管中,于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次,再离心,将
二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。
(2)总糖的水解和提取
准确称取I.OOg食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL6MHCI,置沸水
浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。
待三角瓶中的水解液冷却后,加入1滴酚酞指示剂,用6mol/LNaOH中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中,
混匀。
将定容后的水解液过滤,取滤液10mL移入另一100mL容量瓶中定容,混匀,作为
总糖待测液。
(3)显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管,编号,按表2所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的0号管。
加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
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五、结果与计算:
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出
相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
&II1I线听衍斷盟糊怎克数还原訓=
提取液总体枳测疋时JR用体积「
样品龜点数
査曲线.所得水斛CihK朗乞克数稀释倍数
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糖的测定方法
核心提示:
对于糖的测定方法有很多,大致可分为三类1.物理法,(1.旋光法,2.折光
法,3.比重法,)2.物理化学法,(1.点位法
團对于糖的测定方法有很多,大致可分为三类
1.物理法,(1.旋光法,2.折光法,3.比重法,)2.物理化学法,(1.点位法,2极普法,3.光度法,4.色谱法)
3.化学方法,(1.斐林氏法.2.高锰酸钾法.3.碘量法.4.铁氰化钾法.5.蒽铜比
色法.6.咔唑比色法)共计三大种,在测定其他碳水化合物时,往往是使其水解为糖再进行测定。
.总糖的测定
食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖,果糖,戊糖,乳糖和在测定条件下能
水解为还原性的单糖的蔗糖(水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖),麦芽糖(水解后为2分子葡萄糖)以及可能部分水解的淀粉(水解后为2分子葡萄糖)。
还原糖
类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基(-CHO或酮基(=C=0)。
测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。
这些方法中,以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。
在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法,蒽铜比色法,斐林氏容量法。
斐林氏容量法由于反应复杂,影响因素较多,所以不如铁氰化钾法准确,但其操作简单迅速,试剂稳定,故被广泛采用。
蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内,但要求检测液澄清,此外,在大多数情况下,测定要求不包括淀粉和糊精,这就要在测定前将淀粉,糊精去掉,这样就使操作复杂化,限制了其广泛应用。
(一)铁氰化钾法
1.原理:
样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质,在碱性溶液中能
将铁氰化钾还原,根据铁氰化钾的浓度和检验滴定量可计算出含糖量。
其反应为下:
GHi2Q+6K3[Fe(CN)6]+6KOH—(CHOH)-(COOH2)+6K4[Fe(CN)6]+4H2O
滴定终了时,稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。
2,试剂1)1%的次甲基兰指示剂
2)盐酸(水解作用)
3)10%和30%的NaOH溶液
4)1%铁氰化钾(贮存特色瓶,临用前标定)标定步骤
称蔗糖I.OOOOg—定容500m|T取此液50m2于100ml容量瓶—加hcl5ml—摇匀
T65-70C水裕15分钟-取出冷却-用30%NaOh中和-加水于刻度-倒入滴定
管中-取10ml1%铁氰化钾于锥形瓶中-加10%NaOH2.5m加12.5ml的水加玻
璃珠颗粒-加热至沸-保持一分钟-加次甲基兰1滴-立即以糖液滴足至蓝色
退去为止,记录用量。
正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液,煮沸1分钟,加指示剂一滴,再用糖液滴定至兰色褪去,计算铁氰化钾溶液的浓度。
A=(W・V)/(1000X0.95)
称取纯蔗糖的量
1000:
稀释比0.95:
换算等数
3.操作方法
稀释10gT用100ml水作溶液-于250ml容量瓶-加20%醋酸铅10ml^至沉淀完为止-加10ml10%NA2HPO4至不在产生沉淀为止-加水至刻度-过滤—取
滤液50m|T于100ml容量瓶中-按铁氰化钾标定法进行转化,中和及滴定
计算糖含量
总糖(以转化糖计%=(AX1000)/(W•V)X
100
样品的重量
(a)达终点时,过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体,隐色体
容量受空气中氧所氧化,很快又变成指示剂的颜色。
(b)整个过程应在低温电炉上进行,滴定要速度,否则终点不明显
(C)糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛,生产物再与蒽铜缩合成兰色化合
物,其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比,单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用,因此不需要水解。
(二)蒽铜的比色法
1.原理:
糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛,生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物,其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比,可比色定量。
2.试剂
硫酸锌溶液:
溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中亚铁氰化钾溶液:
溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中
(3)
0.2%蒽铜试剂:
溶解蒽铜0.2g于100ml95%硫酸中,置棕色瓶中冷暗处
保存
0.1%葡萄糖液:
准确称干燥葡萄糖0.1000g定容100ml
3.操作方法
(1)标准曲线绘制
(2)100ml容量瓶编号
沸水浴加热6分钟,取出冷却-用1cm比色杯T610nm测定吸光度-作出以吸光
度为横坐标,糖液浓度为纵坐标的准
曲线
(3)样品测定
称10g样品-于100ml热水加入500ml容量瓶中—加硫酸锌5ml^沸水浴5分钟
T取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml,-冷却-定容500m|T过滤-吸滤液25ml
于250ml容量瓶-定容250m|T取稀释液1ml,于比色管中-加10ml蒽铜试剂-摇匀—水浴加热6分钟—冷却—比色试验注意
二.还原糖的测定方法还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖,在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎,在果糖分
子中含有淤青的酮茎,在乳糖中和麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎,因此都有还原性。
在测定还原糖时一般测定总糖
时所有将糖类水解为转化糖再测定的方法都可用来测定还原糖。
(一)斐林氏容量法
1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。
只是样品溶液不必以过转化,
而是直接取滤液进行滴定,滤液进行滴定,滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%
为好,又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调节。
10毫升费林氏A、B液混合
时理论上相当还原糖量如下:
葡萄糖(无水)果糖或转化糖尿病0.0500克
乳糖尿病
麦芽糖
0.0678克
0.0807克
2试剂
(1)斐林氏A液,称69.8gcp硫酸铜于100ml水中,过滤备用
(2)斐林氏B液,称34.6g.cp浓流锌钠和100gcpNaOH于1000ml水中,过
滤备用
3方法
称取样品10-20g:
制备与转化同铁氰化钾法。
将样液倒入滴管中,吸取A,B液
准备预滴定预滴定:
吸A、B液各5m|7从滴管中加15ml样液—加热至沸—继续滴加样液—至兰色变潜-加3滴次甲基兰—在1分钟内滴定到终点达到终点时,稍微过量的转化糖,将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体,而显出氧化亚铜的红色,去碱性条件下加热糖的产物是复杂的。
去碱性中断裂是由于碱度不同,加热时间不同,生产不等的碎片,这种碎片给后面滴定带来误差,而且,这种碎片与糖没有化合量的关系,所以,Lanecrol-Eynon
Method作出数据检索表
正式滴定:
吸A,B液各5ml—于三角瓶—加比预定量少0.5-1.0ml样液—2分钟内要求沸腾1分钟—加3滴指示剂—用样液滴定兰色消失
总沸腾时间为3分钟,即滴定在3分钟完成。
计算:
还原糖=(F•V)/(W•V)X100
F:
转还糖回数,即与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数,
Vi:
样品试液总体积
V2:
样品试液滴定量
W样品重量
在测量乳糖制品时,若蔗糖与乳糖的含量比超过3:
1时,则应与滴定量中加上
相关表中(课本中表9-8)校正值后在进行计算
我们举例如下:
如果标准果糖溶液度为每
100ml溶液含糖262.5mg。
对于10ml斐林试液从9-5
可以查得果糖液滴定应为
20ml。
如果不是20ml,可先算出A,B液校正等数。
然
后进行计算
再如标准糖溶液浓度为每
100ml溶液含糖199.3ml,对于10mlA,B液从9-4中
查到,糖液滴定量应为25.00ml,若有出入可校正。
如果要求不高,可省略校正
步骤但要求1%得测定误差,则省略校正。
另外有时候并未根据检索表计算样
含糖量,但对A,B液进行标定,以使确定相当得还原糖量。
这种误差为0.5%。
F面我们讲标定量A,B液
准确准确称取烘干冷却得A.R蔗糖1.5gT用水溶解称取250ml容量瓶中-定容
-吸50ml于100ml定量瓶中-加HCL5mP再65-70摄氏度水裕15分钟-冷却
—用30%NaOh中和—定容
准确吸A,B液各5ml于三角瓶中-加水约50ml玻璃珠三粒-加热至沸-保持1分钟7加指示剂1滴7再煮1分钟7立即用糖液滴定至兰色褪去,红色出现即为终占
—、八\、
正式滴定,先加入比预滴定时少0.5ml左右得糖液煮沸1分钟7加指示剂1滴再煮沸1分钟7继续滴至终点计算:
A=W*V/500X0.95
A:
相当于10ml斐林氏AB液的转化糖的量
V:
滴定蔗糖的量
500:
稀释比0.95:
换算等数最后计算:
总糖(还原糖)以转化糖计%=(A*1000/W*V)*100
制取样品的量
1000:
是稀释倍数(100/50*500)
1.预测定的目的:
对样品溶液中还原糖浓度有一定要要求(0.1%左右),测定时
样品溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近,通过测定了解样品
浓度是否合适,浓度过大或过小应该加以调整,使测定时消耗样品溶液量在10
毫升左右;二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量,以便在正式的滴定时,预先加入比实际用量少1毫升左右的样液,只留下1ml左右的样液在续滴定时加入,以便保证在1分钟内完成续滴定工作,提交预测定的准确度。
2.此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度,煮沸时间和滴定速度一般煮沸时间短消耗糖多,反之,消耗糖液少,滴定速度过快,消耗糖量多,反之,消耗糖量少。
另外溶液碱度愈高,二价铜的还原愈快,因此必须严格
控制反应的体积,使反应体系碱度一致。
热源一般采用800W/电炉,反应液在2
秒内沸腾。
(二)KMNO(高锰酸钾法)1.原理,还原糖在碱性溶液中使铜盐还原成氧化亚铜,在酸性条件下,氧化亚
铜能使硫酸铁还原为硫酸亚铁,再用KMNO溶液滴定硫酸亚铁,即可标出还原糖的量。
2.操作方法
(1)样品处理
a.乳糖:
包括乳制品以及含蛋白质的冷食类
称样2-5g(液体样25~50ml)—于250ml容量瓶—加水50ml^加A液10ml+1N
NaOH4ml-定容-静置30秒-过滤-弃去初液-可测还原糖及蔗糖用。
b.低酒度饮料:
麦精露、各类汽酒等饮料。
先暴气除CO—取100m|T于蒸发皿中-用1NNaOH中和-沸水浴蒸至原体积四
分之—转入250ml容量瓶—加50ml水—摇匀—(加A液10ml—加1NNaOHIml)
-加水至刻度-静置30秒—过滤。
c.含多量淀粉的食品:
婴儿食品、糕干粉、宝宝乐、代乳粉、饼干、面包、糕
点等
称样10-20gT250ml容量瓶-加水200ml^45度水浴加热1小时-不停摇动-
冷后加水至刻度-静置-吸出清夜200ml于另一容量瓶(250ml)T加A液10ml+1NNaOH4mK静置30秒—过滤。
d.汽水、果露、国产七种可乐及可口可乐
处理CO^吸样液100m|f于250ml容量瓶f加水至刻度f可测还原糖及蔗糖。
(2)测定方法
取50ml处理的样液f于400ml烧杯f加AB液各25m|f加热在4min左右沸腾f再煮2minf趁热抽滤f用60C水洗烧杯和沉淀f直到洗液不成碱性f将抽滤
的纸(或者石棉)及Cu^Cf转入原来烧杯f用25ml硫酸铁溶液冲洗抽滤瓶f使冲洗液全部洗入原烧杯中f加水25mlf使CuO溶解f用0.1NKMnO标液滴定至
微红色,同时用50ml水按上述方法做空白实验。
(3)计算
3.注意事项:
(1)煮沸后的溶液显红色不显兰色,则表示糖量高,可减少取样体积。
(2)在洗涤CsO的整个过程中应使沉淀上层保持一层水层,以隔绝空气,避
免CiiO被空气中的氧所氧化。
(3)此法适用于各类食品中还原糖的测定,有色样液不受限制,准确度高,重
现性好。
准确性和重现性都优于直接滴定法,但操作复杂、费时,需使用特制的咼锰酸钾法糖类检索表。
(二)直接滴定法(斐林氏溶液法)
1.原理
样品经过处理除去蛋白质等杂质后,加入盐酸,在加热条件下使蔗糖水解为还原
性单糖,用直接滴定法测定水解后
样品中的还原糖总量。
2.试剂
3.方法
(1)取过量样品进行提取,放入250ml容量瓶,加5ml醋酸锌和5ML亚铁氰
化锌,定容,静止30分后过滤,滤液备用。
(2)测定样品预滴定:
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml,玻璃珠数粒,加热在2分内沸腾,趁热
滴定,滴定到兰色褪去,记录用量。
正式滴定:
取A、B液各5mL于三角瓶-加玻璃珠三粒-从滴定管直接加比预滴定时少
0.5-1.0ML样液,在2分沸腾,趁热滴定兰
色褪去,记录,取三次平均值计算结果。
三.蔗糖的测定
1.原理:
样品除蛋白质后,其中的蔗糖经盐酸水解转化为还原糖,用还原糖的
测定方法,确定样品中蔗糖的含
量。
实际上测定还原糖包括两部分:
一是样品中原有的还原糖、二是蔗糖经酸水解后
的还原糖。
2.方法
吸还原糖样品处理稀释液50m—于100ML容量瓶-加-于68-70度水浴上15分
-冷却-加甲基红2滴-中和-定容-
取此溶液按还原糖的测定方法测定。
2.计算
蔗糖%=F(100/V2-100/V1)/(WX50/250X1000)X100X0.95
式中:
F:
10ml斐林氏试液相当于转化糖的质量mg
V1:
测定时消耗未经水解的样品稀释体积ml
V2:
测定时消耗经过水解的样品稀释体积ml
W:
原测定还原糖时样品的重量(G)1000:
将毫升换算成克
0.95:
分子的蔗糖经水解后成为2分子的还原糖(一分子的葡萄糖和一分子的果糖)蔗糖的分子量为342,后来成为2X180.则342/360=0.95.所以转化糖换算到蔗糖应乘以0.95.
四.纸上层析法.
在食品中,糖的组分较为复杂,在淀粉糖浆中含有麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖等多种组分.对于这些食品中的各种组分,不可能用化学分析方法进行测定,而用物理分析方法进行测定.
纸层析应用于糖类的分离分析,它利用混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同速度移动而达到分离.
比移值R==组分展开的距离/溶剂展开的距离糖的RF值的规律为:
单糖>双糖>三糖戊糖>己糖酮糖〉醛糖实验室常用的展开剂:
正丁醇:
HAc:
H2O==4:
1:
5常用的显色剂:
0.1NAgNONH4OH(SN)=1:
1(灵敏度高,但斑点易扩散)
ANQ/丙酮:
NaOH/乙醇=1:
1(克服上面缺点)
(显色剂书上给出许多,同学们可以自己看)
样品的处理可采用常规法如:
糖的提取和蛋白质的除去可看前面讲的。
根据R值可求出各种糖的R与标准样品的R值进行比较,可确定出糖的种类,也可进行定量,用斑点光密度定量法直接在滤纸上测定.用斑点面积校正进行定量。
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- 关 键 词:
- 还原 测定 35 硝基 水杨酸 比色