雌激素通过瘦素信号通路途径调节脂肪细胞代谢生成.docx

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雌激素通过瘦素信号通路途径调节脂肪细胞代谢生成

雌激素通过瘦素信号通路途径调节脂肪细胞代谢生成

雌激素通过瘦素信号通路途径调节脂肪细

胞代谢生成#

李文娟，许良智，陈焱，牟丽，许文明，程萌，庄静，李婷婷，詹晶**

5

10

15

20

25

30

35

40

（四川大学华西第二医院，成都610041）

摘要：

目的：

探讨雌激素是否是通过瘦素相关信号通路对女性形体改变产生影响。

方法：

二

月龄雌性SD大鼠随机为去势组及假手术组，术后14周收集生殖器周围脂肪、内脏脂肪和

皮下脂肪，并分别检测瘦素受体表达，同时通过17-β雌二醇及瘦素对脂肪细胞前体细胞

MSCs进行干预，检验瘦素受体亚型、瘦素表达及成脂分化的指标PPARγ的变化。

结果：

通过对造模期间大鼠体重的每周监测，发现去势组体重增长及术后14周Lee’s指数均明显

高于假手术组P0.001。

瘦素受体在去势组的脂肪组织中表达显著增加，内脏脂肪中尤为明

显。

体外实验显示，随着瘦素和雌激素浓度的增加，MSCs上瘦素长形受体和短受体的表达

均随之下降；随雌激素浓度的增加，MSCs中瘦素表达呈下降趋势，同时，MSCs中PPAR

γ表达也受到抑制。

结论：

在低雌激素的影响下，去势后大鼠发生类似绝经后女性样的形体

改变，高浓度雌激素可抑制大鼠间充质干细胞向脂肪细胞分化，雌激素对瘦素及瘦素受体的

影响可能是绝经后女性体型变化发生变化的原因。

关键词：

妇产科学；雌激素；瘦素；瘦素受；脂肪；间充质干细胞

中图分类号：

R339.6

Estrogenregulateadipocytemetabolismthroughleptin

signalingpathway

LIWenjuan,XULiangzhi,CHENYan,MULi,XUWenming,CHENGMeng,

ZHUANGJing,LITingting,ZHANJing

WestChinaSecondUniversityHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041

Abstract:

Postmenopausalwomenoftenpresentobviousbodycompositionchangesunderthe

absenceofestrogen,includingoverweight,obesityandandroid-likebodyfatdistribution,

thereforeposesseriousthreatenforwomen’shealth.Althoughtheintimaterelationshipbetween

estrogenandbodyappearancehavebeennoticed,mechanismremainsunclear.Weassumedthat

estrogenmayregulatefatdistributionthroughaffectingleptinsignalpathway,whichhasbeen

shownplayingmajorroleinenergyhomeostasis.Totestthishypothesis,werandomizedfemale

SDratintoovariectomyOVXandshamgroup,andthencollectedadiposetissuearoundgenital,

retroperitonealandsubcutaneousafter14week.Leptinreceptorexpressioninadiposetissuewas

measuredbywesternblot.Resultsindicatedthatleptinreceptorweresignificantlydown-regulated

inovariectomygroup,especiallyinfataroundgenital.Weightchangeswereobservedeveryweek,

repeatedmeasuresanalysisofvarianceshowedthatOVXgrouphashigherweightgaincompared

withshamgroupduringthe3monthP0.001,andsodoestheLee’sindexP0.001,which

werecalculatedattheendofthestudy.WefurtherusedmesenchymalstemcellsMSCs,the

progenitorofAdipocytesasaninvitromodeltofigureouttheeffectofestrogenonleptinreceptor

expression.AfterMSCsweretreatedbyincreasingconcentrationof17-βestradiolandletpin

respectively,QPCRwereusedtotestthemRNAexpressionofleptinreceptorsubtype,OBRb

longformandOBRashortform.Negativecorrelationwasnoticedbetweenestrogen

concentrationandleptinreceptorsubtypeexpression.Similartendencywerealsoobservedin

leptintreatmentgroup.Besides,theexpressionofleptininMSCswasdegradingaccompaiedwith

increasingconcentrationofestrogen,andPPARγ,theindicatorofadipogenisis,wasalso

基金项目：

高等学校博士学科点专项科研基金（201XXXXXXXXXX7）；自然科学基金（81070464）

作者简介：

李文娟（1986-），女，在读博士，主要研究方向：

妇产科生殖内分泌

通信联系人：

许良智（1957-），女，教授，主要研究方向：

妇产科生殖内分泌.E-mail:

liangzxu@126

-1-

45

supressedundertreatmentofestrogen.Estrogenmayactonleptinreceptorexpressiontoinfluence

thebodycompositioninpostmenopausalwomen.Andthesimilarmolecularmechanismof

estrogenandleptinshowsthatthesetwohormonesprobablyhavesynergisticeffectsonenergy

metabolism.

Keywords:

Gynecology;Estrogen;Leptin;Leptinreceptor;Adipose;Mesenchymalstemcells

50

0引言

体重增加、肥胖、男性样脂肪分布等一系列体型变化等是高血压、糖尿病、代谢综合征

等多种常见疾病的危险因素，对生命健康有显著影响，而围绝经期和绝经后女性伴随着雌激

素下降出现以上改变的比例较绝经前明显增加[1,2]。

在60岁之前，女性的体重指数（bodymess

55

60

65

70

75

80

index，BMI）随年龄增加而逐渐上升，60-64岁时BMI的平均水平达到高峰，绝经后女性

的BMI也与血清中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）

存在显著相关性[3,4]。

尽管雌激素对女性形体的影响已经引起了学者们的广泛关注，但具体

机制仍不清楚。

瘦素是由位于染色体7q31.3区肥胖基因编码的一种蛋白类激素，主要由白色脂肪细胞

分泌，脂肪分布及代谢和调节能量稳态的重要激素，与能量及糖脂代谢密切相关，具有广泛

的生物学效应，肥胖人群多伴发高瘦素血症。

间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）

是脂肪细胞前体细胞，含有雌激素受体和瘦素受体，在特定条件下（如胰岛素、地塞米松、

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛等）可以定向分化为脂肪细胞。

目前研究报道雌激素在

体外有促进间充质干细胞增殖的作用[5]，但对雌激素是否能影响MSC向脂肪细胞的分化，

是否是通过瘦素系统引起绝经后妇女体型改变仍不清楚。

为解决以上问题，本文章从动物模

型和体外实验两方面入手，对雌激素影响绝经后女性体型的机制进行研究分析。

1材料与方法

1.1动物模型建立

40只2月龄雌性SpragueDawley（SD）大鼠及饲料均由四川省医院动物中心提供，大

鼠体重210.84±7.32g，根据体重分层随机分为去势组（OVX）和假手术组（sham）。

术后，

两组动物均在室温22-26°C，每天12小时光照，固定消毒，通风良好的相同条件下喂养。

自由摄水摄食。

由华西医科大学实验动物中心提供。

喂养期间每周测量大鼠体重，14周水

合氯醛麻醉后断颈法处死所有动物，收集大鼠血清、内脏脂肪（肾周）、生殖器周围脂肪和

皮下脂肪。

1.2细胞体外培养及干预

选择体重180-220g的2月龄SD雌性大鼠，水合氯醛麻醉后断颈法处死大鼠，在无菌条

件下分离出大鼠长骨（股骨和胫骨），除去骨表面附着的肌肉组织，暴露骨髓腔，用注射器

吸培养基（EMDM-LG低糖，10%FBS，1%青链霉素）反复冲洗冲洗骨髓腔，以6*107/ml

为密度接种到60mm培养皿中，37°C、5%CO2、饱和湿度的孵箱（ThermoElectronCorporation

3110）培养。

原代细胞培养48小时候更换培养基，弃去培养基中未贴壁细胞，贴壁细胞每

三天更换一次培养基，细胞长至80%融合状态以0.25%胰酶1:

2传代。

对培养的第1、2、3

代细胞分别进行带荧光标记的CD3-Alexa488/CD29-APC和CD44-FITC/CD45-Alexa467

（biolegend）染色，采用流式细胞仪器（FACSCanto,BectonDickinson）检测并用软件

-2-

FACSDivaSoftwareBectonDickinson对培养细胞的表面抗原进行鉴定分析。

选择生长良好，

85

90

95

100

105

110

115

纯度满意（80%）的第三代MSC作为后续研究的细胞模型。

MSC体外培养添加17beta雌

二醇（sigma）浓度为10-5至10-10M，瘦素（R&D）浓度为75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml。

1.3瘦素受体蛋白表达检测

研究采用westernbolt方法检测并比较不同脂肪组织中的OBRb表达。

PBS洗培养基后，

在培养皿中加入含1:

100PMSF的PBS并刮取培养细胞，1000rpm4℃离心10min，弃上清取

沉淀。

配RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂PIMIX1:

100，PMSF1:

100）冰上裂解1小时，期

间每10分钟涡旋一次，之后超声裂解细胞，14000rpm4离心20min。

取上清，用BCA

（Biored）法进行蛋白定量，每个样本上样总量为20ug。

蛋白制品混匀在loadingbuffer内，

95°C变性5分钟后上样，在十二烷基硫酸钠SDS溶液中100V电泳80分钟，采用槽式湿

转法冰上80V*90分钟将蛋白转至PVDF膜Millipore,Bedford,MA上，室温5%封闭液中封

闭PVDF膜一小时。

封闭后PVDF膜4°C孵育一抗过夜（ObR单克隆抗体1:

1000稀释,Santa

CruzBiotechnology,SantaCruz,CAandGAPDH单克隆抗体1:

1000稀释,Abcam,Inc.）。

15ml

TBST洗15分钟*3次后，加入合适稀释度辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（中杉生物），

室温孵育2h，缓慢摇动。

15mlTBST洗膜15分钟*3次后，化学发光法显色（millipore），

胶片法曝光kodak。

胶片扫描后，灰度值计算分析采用NIH提供ImageJ软件

。

1.4瘦素、瘦素受体及脂肪分化指标mRNA表达检测

研究采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测MSC在雌激素和瘦素影响下OBRa、OBRb、

leptin和PPARγ表达。

3代MSC体外进行试剂干预8小时后，根据试剂厂家指南采用Trizol

reagentInvitrogen,GrandIsland,NY提取细胞总RNA。

总RNA采用分光光度计Thermo

检测密度，并计算逆转录PCRRT-PCR上样所需500ngRNA体积，RT-PCR试剂盒Takara,

Tokyo,Japan将总RNA在37下逆转录30分钟为cDNA。

为了解各个样本中目的基因的

表达水平，采用含5ulSSOFastEvaGreen反应超混液Bio-red,Hercules,CA，1ul2.5uM

上游引物，1ul2.5uM下游引物，3ul稀释10倍的cDNA模板为体系。

引物设计采用primer

premier5.0PREMIERBiosoftInternational,PaloAlto,CA，生工生物合成，各个引物序列，

产物长度，退火温度及扩增效率见table1。

混合后体系在qPCR反应仪Bio-red中扩增：

伸

展50°C*2min，变性95°C*2min,45个循环扩增（变性95°C*15sec之后退火温度*30

sec）,65°C延伸5min，95°C*1sec后结束.基因表达量结果采用qPCR反应仪自带软件

CFXManagerTMSoftwareBio-red进行分析。

表1定量PCR引物序列

Tab1.Gene-Speci?

cPrimersinfromationforqPCRAnalysis

Gene

primerTm°C

Product

bp

efficiency

%

OBRa

Sense

5'

TTGAAGGAAGGAAGCAAACC3'

59

109

100.9

anti-sense

5'

CATCAAACCTACATTGTGACCA3'

OBRb

Sense

5'

TCTGGAGCCTGAACCAGTTT3'

59

117

105.7

anti-sense

5'

TGTGGAATCTGGAGTGGTCA3'

Leptin

Sense

5'

CATGCTGGAAGACGCACTTA3'

57

146

104.6

anti-sense

5'

GGCAAGACCCATCAGTAGGA3'

PPARγ2

Sense

5'

TCTCACAATGCCATCAGGTTT3'

58

165

111.7

anti-sense

5'

TTTGGTCAGCGGGAAGG3'

GAPDH

Sense

5'

TATCGGACGCCTGGTTAC3'

59

138

102.4

anti-sense

5'

CTGTGCCGTTGAACTTGC3'

-3-

1.5统计分析

一

onewayANOVA；计数资料采用chi-squaretest。

造模后体重变化采用重复测量的方差分析。

以P0.05为差异有统计学意义。

所有分析使用软件SPSS16.0。

120

125

130

135

2结果

2.1去势后动物模型建立

术后14周，去势组血清FSH50.2315.95IU/L，雌二醇水平37.148.56pg/ml，假手术

组血清FSH6.685.55IU/L，雌二醇水平58.9410.36pg/ml。

采用两样本t检验分析后，

结果发现，去势组FSH明显高于假手术组（P0.001），而雌二醇水平显著低于假手术组

（P0.01），去势模型建立可靠（图1）。

AB

图1A造模14周后大鼠血清FSH；B造模14周后大鼠血清E2

Fig.1serumFSHtest14weeksaftersurgeryofrat;serumE2test14weeksaftersurgeryofrat

2.2去势后动物体重体型变化

根据体重将实验大鼠分层随机分为去势和假手术组，两组体重没有显著差异（OVX

211.257.07VSSham210.797.92，P0.05）。

造模14周期间，每周固定时间检测大鼠体

重水平，并计算每周体重较前一周增减量，处死前麻醉后测量大鼠身长并计算Lee’s指数，

采用重复测量方差分析对两组体重改变情况进行分析，Lee’s指数采用两样本t检验分析。

结果显示，两组体重改变差异明显（P0.001）（图2），造模后大鼠体重Lee’s指数显著

增加（P0.001）（图3）。

图2术后大鼠每周体重改变

Fig.2weightchangesperweekaftersurgeryofrat

-4-

图3术后14周大鼠Lee’s指数

Fig.3Lee’sindexofSDrat14weekaftersurgery

140

145

2.3大鼠脂肪组织瘦素受体蛋白表达

造模14周后，本研究对收集的两组内脏脂肪、生殖器周围脂肪和皮下脂肪分别进行

Westernblot检测OBRb表达情况，以GAPDH表达量为内参进行统计分析。

图4可见，在

内脏脂肪中，去势组瘦素长型受体（OBRb）的表达量显著高于假手术组（58.01%VS10.65%，

P0.0373）；在生殖器周围脂肪中，去势组OBRb表达量也明显增加（115.22%VS39.65%，

P0.0375），见图5五；在皮下脂肪中，尽管OBRb表达量在去势组高于假手术组，但差

异没有统计学意义（63.00%VS15.77%P0.1173），见图6。

内脏脂肪组织OBRb表达

Sham

Sham

Sham

OVX

OVX

OVX

150

内脏脂肪组织GAPDH

Sham

Sham

Sham

OVX

OVX

OVX

155

图4westernblot检测造模后内脏脂肪组织OBRb表达

Fig.4OBRbexpressioninretroperitoneaadiposetissuetestedbyWB

生殖器周围脂肪组织OBRb表达

Sham

Sham

Sham

OVX

OVX

OVX

160

生殖器周围脂肪组织GAPDH

Sham

Sham

Sham

OVX

OVX

OVX

-5-

165

170

图5westernblot检测造模后生殖器周围脂肪组织OBRb表达

Fig.5OBRbexpressioninreproductiveadiposetissuetestedbyWB

皮下脂肪组织OBRb表达

皮下脂肪组织GAPDH

Sham

Sham

Sham

OVX

OVX

OVX

175

180

185

图6westernblot检测造模后皮下脂肪组织OBRb表达

Fig.6OBRbexpressioninsubcutaneousadiposetissuetestedbyWB

2.4E2和leptin对MSC上瘦素长型受体（OBRb）与短型受体（OBRa）的表

达情况

本研究采用了大鼠成骨全骨髓培养的方法获得原代MSCs，在消化传代过程中分离骨髓

中丰富的造血干细胞，一代细胞生长约6-7天。

培养的细胞通过流式细胞术及分化诱导液进

行鉴定。

由于MSCsCD29CD44表达阳性CD45CD3表达阴性，而造血干细胞则相反，本研

究引入以上四个检测指标通过流式细胞术对培养的细胞进行鉴定，结果显示第三代细胞中表

达CD29阳性CD3阴性的细胞占80.2%。

采用qPCR的方法检测对E2和leptin干预8小时后MSCs上各瘦素受体亚型的影响。

在不同浓度干预之后，OBRa表达在两个药物各浓度组与control组比较未见显著性差异，

但是可以看出OBRa在两组均显示出了随药物浓度增加而下降的趋势（图7）。

OBRb表达

在letpin75ng/ml、100ng/ml及低浓度的E2均显示出明显的上调作用，两个药物浓度对OBRb

的关系显示出与OBRa同样的趋势（图8），以上结果说明leptin与E2对瘦素受体各个亚

-6-

190

195

200

205

型显示出同样趋势的调节效应。

AB

图7AqPCR检测不同浓度瘦素干预后OBRa表达；BqPCR检测不同浓度E2干预后OBRa表达

Fig.7OBRaexpressionundertreatmentofleptintestedbyqPCR;OBRaexpressionundertreatmentof