E coli pUC19质粒的提取纯化与检测.docx
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EcolipUC19质粒的提取纯化与检测
实验一E.colipUC19质粒的提取、纯化与检测
一、实验目的
1.掌握碱变性法提取法的原理及各种试剂的作用。
2.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
3.学习凝胶的制备及电泳方法。
4.学习并掌握凝胶电泳分离纯化DNA的实验。
二、实验原理
1.细菌质粒DNA
细菌细胞内的DNA按照分布主要有染色体DNA(ChromosomeDNA)与质粒DNA(PlasmidDNA)两类,其中质粒是一种环状的双链DNA分子,是独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。
质粒在细胞内以共价环状DNA(cccDNA)的形式存在,呈超螺旋状态。
在质粒提取过程中,由于机械外力的作用,质粒的天然超螺旋结构遭到破坏,如果一条链完整,另一条链存在缺口时,称为开环DNA(ocDNA;若双链DNA均发生断裂,则呈线状DNA(LDNA)不同的质粒DNA尽管分子量相同,但是分子的大小不同,电迁移速率不同,因此可以通过多种方法将同构型的质粒DNA区分开。
本次实验要提取的质粒是具有Ampr标记的pUC1。
2.碱变性法提取质粒DNA
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.0的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。
而质粒DNA(cccDNA)的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH=4.6的NaAc(或者KAc)高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,重新溶解在溶液中;而染色体DNA不能复性,而与其他大分子形成缠连的网状结构,形成白色絮状沉淀。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
再用无水乙醇和盐溶液将溶于上清液中的质粒DNA沉淀,再用RNase除去RNA,粗提物中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后可获得较纯净的质粒DNA。
3.琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。
凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。
琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。
它首先利用琼脂糖的分子筛效应,不同大小的分子的通过速率不同;此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动,电荷的多少与泳动速率亦存在着相关关系。
根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,不同的DNA分子就能够以不同的速率通过介质运动而相互分离。
另外琼脂糖凝胶电泳配套使用的荧光插入性染料溴化乙锭(EB)能插入双链DNA。
利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置,并能够在有参照的情况下半定量地对某条带的DNA片段的含量进行估计。
三、实验材料试剂
1.实验材料
①E.coliDH-5α受体菌(含有Ampr标记的pUC19质粒)。
②DNAmarkerλHindⅢ(TaKaRa公司产品)
③pUC19质粒(TaKaRa公司产品)
2.培养基和试剂
①LB培养基:
(液体)胰蛋白胨10g,,酵母粉5g,NaCl10g;加蒸馏水溶解,用NaOH调PH至7.2—7.4,加水至1000ml,121℃高压灭菌15min;(固体)其他成分同液体,配好后加入1.5%的琼脂粉,121℃高压灭菌15min。
②抗生素:
氨苄青霉素(ampicillin),配制成100mg/ml母液备用。
③溶液Ⅰ:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl(pH=8.0),10mmol/LEDTA(pH=8.0),。
高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
④溶液Ⅱ:
200mmol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液加无菌水稀释),1%SDS(从20%SDS母液中稀释),现配现用。
⑤溶液Ⅲ:
5mol/LKAc60mL,冰醋酸,重蒸水,高压灭菌,4℃冰箱保存。
溶液终浓度为:
K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
⑥TE缓冲液:
10mmo/LTris-Cl(pH=8.0),1mmol/LEDTA(pH=8.0)。
高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
⑦RNaseA母液:
将RNaseA溶于含10mmol/LTris-HCl(pH)和15mmol/LNaCl的溶液中,配成10mg/mL溶液,100℃加热15min冷却后分装至1.5mL无菌离心管,-20℃保存。
⑧3mol/LNaAc。
⑨饱和酚。
⑩氯仿/异戊醇混合液:
氯仿:
异戊醇(体积比)24:
1的比例在氯仿中加入异戊醇。
预冷的无水乙醇、70%乙醇。
6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝,30%甘油),冻存。
10×TAE电泳缓冲液(40mmol/LTris,20mmol/LNaAc,1mmol/LEDTAPH=8.0)。
琼脂糖(Agarose)。
1×TAE缓冲溶液,用量筒量取40mL50×TAE缓冲溶液定容至2L,得到1×TAE缓冲溶液,供全班使用。
溴化乙锭水溶液(10mg/ml)避光保存。
3.器材用具
接种针、10ml移液管 、洗耳球、三角瓶(300ml)、 量筒、冰块、牛皮纸、线绳、纱布、棉花、塑料手套、乳胶手套、酒精灯。
电子天平,恒温振荡培养箱、高速冷冻离心机、台式离心机、漩涡振荡器、微波炉、电泳仪、紫外灯(紫外观察仪)。
Eppendorf离心管(50mL、1.5mL)、微量移液器(1000μL量程、50μL量程、10μL量程)、移液器枪头(蓝、黄)、制胶槽、电泳仪、18孔梳子。
四、实验步骤
1.实验准备
按照实验材料试剂列出的清单和配制方法,进行试剂的配制(配制完成后灭菌或冷冻保存)和实验仪器的准备。
2.细胞培养
在含有Ampr的LB平板上接种含pUC19质粒的E.coliDH-5α菌株,37℃下培养过夜。
Ampr上寻找生长良好的菌落,转接到50mL含Ampr的LB液体培养基中,37℃,150rpm振荡培养过夜。
取菌液以50%接种量接种于新的LB液体培养基中,37℃,150rpm振荡培养4~6h至菌体生长至对数期备用。
3.质粒DNA提取
取50mL离心管,称得其重量W1—2.0cm;6000rpm,4℃,离心5min,弃上清液。
用移液器移取5mL溶液I,在漩涡振荡器上振荡悬菌;6000rpm,4℃,离心5min,弃上清液,将管倒置于纸巾,使液体流尽,称得其重量W2;得到湿菌体的质量(W2-W1)=153mg。
,混匀后冰浴5min;再加入ⅡⅢ,颠倒混匀,冰浴10min;12000rpm,4℃,15min。
转移上清液至新50mL管,记下转移体积V1=400μL;加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃保存30~60min;12000rpm,4℃,15min,弃上清。
加入5mL70%的乙醇溶液,倾斜并转动离心管使之与管壁充分接触;12000rpm,4℃,15min,弃上清;再次用70%的乙醇溶液清洗,将管倒置于纸巾,使液体流尽;37℃干燥10—15min。
加入1mLTE液体溶解沉淀;转至1.5mL离心管。
向粗提取中所得的1mL溶液中加入10mg/mL的RNaseA母液15μL使得RNaseA浓度为150μg/mL;37℃60min~120min。
4.质粒DNA纯化
将得到的DNA溶液平均分装于2个1.5mL的离心管中,每管500μL,分别加入等体积的饱和酚溶液,涡旋振荡混匀;离心12000rpm,5min。
转移上层水相至新离心管中,记下转移体积V2(400μL,400μL);分别加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:
24:
1),用涡旋振荡器悬菌;离心12000rpm,5min。
转移上层水相至新离心管中,记下转移体积V3(350μL,350μL);加入氯仿/异戊醇混合液(24:
1),混匀;离心12000rpm,5min。
转上清至新离心管记下转移体积V4(320μL,310μL);加入1/10体积的3mol/LNaAc和2倍体积的预冷的无水乙醇混匀,-20℃冰箱中保存60min;12000rpm,15min,弃上清。
加入500μL的70%乙醇溶液;12000rpm,4℃,5min,弃上清;再次用70%的乙醇溶液清洗,37℃恒温培养箱干燥10min。
每管加入25μLTE溶解,,可用指肚轻而快的弹动离心管加速溶解,备用。
5.DNA纯度检测——琼脂糖凝胶电泳
用量筒量取40mL1×TAE于300mL的三角瓶中,再加入0.4g琼脂糖,微波炉中加热沸腾2~3次,至溶液澄清。
插入18个孔梳子(),待凝胶温度冷却至50~60℃后,缓缓倒入制胶槽(如果表面有气泡,就用移液器吸头将气泡移动到制胶槽边缘),等到凝胶完全凝固后变成乳白色不透明状,将梳子拔出。
用拇指与食指轻轻移动胶板两侧,将凝胶体连同制胶槽放入加有1×TAE缓冲液的电泳槽中,TAE缓冲液应当刚好没过凝胶约1mm。
移液器移取3μL样品与1μL上样缓冲液混合,低速离心;离心完毕后,移取3μL混合液,右手持移液器,左手扶住移液器,移液器吸头深入液面下,在加样孔的上方,将液体缓慢压出,由于密度大,样品混合液缓慢沉入加样孔中。
(注:
不同的泳道除了在加提取的样品外,还加入了未经RNaseA处理的对照组样品、DNAmarkerλ/HindⅢ(TaKaRa公司产品)、pUC19质粒(TaKaRa公司产品)以及DNAmarkerλ/HindⅢ+EcoRI处理过的pUC19质粒等作为参照。
)
点样完毕后,盖好电泳槽的盖子,选择电泳电压(不大于5V/cm,本次选择100V)及电泳方向,打开电源开关开始电泳,DNA样品从负极向正极移动。
当前沿指示剂接近胶的前端1/3处时(实际电泳时间1h左右),停止电泳,打开槽盖。
戴上乳胶手套将凝胶取出,并用塑料板轻轻放入已经配好的EB染液中,避光染色10min,用塑料板转移至双蒸馏水中浸洗10min;浸洗完毕后取出凝胶,将凝胶放入紫外灯下观察并拍照。
五、结果与讨论
经过提取和纯化的样品的电泳结果如下图:
123456789101112131415161718
①
⑤
kbp
kbp
②
kbp
③
⑥
2.32kbp
kbp
④
思考题
⑦
⑧
图1碱变性法提取及纯化质粒pUC19电泳结果
图注:
Lane1:
DNAmarkerλ/HindⅢ(10μLTaKaRa公司产品,开链);Lane2:
pUC19质粒(100ngTaKaRa公司产品)Lane3:
λ/HindⅢ+EcoRI处理过的pUC19质粒;Lane4、15:
λDNA(开链);Lane5—14:
7—11组的样品,每组两管样品,上样3μL/管(Lane6未经RNaseA处理的对照组样品、Lane13、14为本组所提取样品)
笔者所在第11组的样品所在Lane13和Lane14,以Lane14为例进行提取样品的分析。
(1)①所指的位置离点样孔最近,如果有白色说明含有杂蛋白;Lane14在此次几乎没有白色条带,说明含杂蛋白很少。
Lane4和Lane15对应区段有白色条带,说明商品λDNA含有杂蛋白,纯度不高。
(2)②所指的位置,根据Lane15⑤所指位置可知,属于λ染色体DNA区带,在此区域内亮度大(含量高),而且由于不同染色体分子量有差异,DNA的提取过程中染色体DNA部分片段化使得该区带宽度较长。
比较可知,Lane14此处亮度很低,说明样品中含有的染色体DNA也较少。
(3)Lane3的样品是λ/HindⅢ+EcoRI处理过的pUC19质粒,由于HindⅢ和EcoRI有特异性的切割,因此pUC19质粒成为线性,显示出一条带(根据实验书附录八,常见限制性内切酶的识别位点,估计是切割出粘性末端),⑥所指示的位置为非正常的线性DNA正常的线性质粒DNA,而Lane14中③所示的DNA是由于提取过程中被酶类切割后变成线性的DNA,由亮度可知含量亦较低。
(4)④所指的位置,与Lane2的pUC19质粒(100ng,TaKaRa公司产品)⑦所示的位置比较可得,此处主要为超螺旋状态的pUC19质粒,而且根据宽度和亮度的关系(宽度之比经过测量大致是1:
2,亮度大于条带⑦)可推测出样品中大约含有300ng的pUC19质粒。
另外在书上差得得pUC19质粒的大小为2.69kbp,而④已经超过了Lane1的marker的2.03kbp条带,这种现象的原因是因为,④的质粒处于超螺旋状态,分子构象比较紧密而Lane1是LDNA,两者的泳动速率没有直接的可比性。
(5)Lane6组没有加RNaseA其条带⑧属于RNA的条带,比较Lane6和Lane14可知,经过RNaseA处理过的组基本上没有出现RNA的条带,说明RNaseA对RNA的分解进行的比较彻底。
六、实验小结
总的看,本次试验电泳拖尾现象控制的较好,条带清晰;杂蛋白、染色体DNA的含量很低,说明提取样品的纯度较高;比较几条泳道的结果,Lane14样品在杂蛋白和染色体DNA的含量上明显少于其他条带,但是在条带③与其他样品对应的条带亮度上差别不大,可能与过程中振荡的激烈程度,保温时间有一定关系,使得一部分超螺旋质粒DNA变成了线性或者开环DNA。
以后应当注意这些条件的控制,在不降低纯度的情况下提高产率。
另外此次实验电泳时间接近一个小时,导致了Lane1的λ/HindⅢDNAmarker
有两条带跑出了凝胶,在结果里只有六条带,而且部分的RNA也跑出了凝胶,虽然不影响此次观察和分析,但是为以后的实验提了醒,注意控制电泳时间。
七、思考题
1、碱变性法提取质粒DNA时,获得高质量的质粒DNA的关键步骤有哪些?
答:
欲获得高质量的质粒DNA,必须彻底除去杂蛋白、染色体DNA和RNA。
①除去染色体DNA的关键步骤是加入溶液II和溶液III时,控制变性与复性操作时机:
既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性,又要使染色体DNA不断裂成小片段,从而能与质粒DNA相分离。
这就要求试剂与溶菌液充分摇匀,摇动时用力要适当。
一般加入溶液I时可用力振荡几次,使得菌体形成均匀的菌悬液,此时染色体DNA尚未释放出来,不必担心其分子断裂。
加入溶液II以后,溶液变得粘稠、透明;加溶液III时,立即会产生白色沉淀。
后两次加溶液,必须注意不能过分用力振荡,但又必须保证溶液混合充分,可上下颠倒离心管数次,直至混匀。
②除去杂蛋白的关键步骤就是在质粒纯化过程中,酚/氯仿/异戊醇混合液还有氯仿/异戊醇混合液的抽提后,取上清液时移液器应当缓缓吸入上清液,而且枪头不要接触到两相之间的杂蛋白层。
③除去RNA的关键步骤在于RNaseA处理样品时应该保证温度和反应时间,使得RNA被充分水解。
2、碱变性法提取野生菌株的质粒DNA时,如果在琼脂糖凝胶电泳板上出现了5条带,则说明该菌株含有5个质粒。
该结论对吗?
怎样验证?
答:
这种结论是没有依据的,因为不同的条带可能是同一质粒的不同构象,每次实验都可能有各种因素造成DNA的解链,如本次实验中,超螺旋质粒DNA后面还有开链DNA的条带。
验证方法:
将每个条带的DNA进行回收,测定其碱基大小,如果相同说明很可能是同一质粒的不同构象;为了进一步验证可以进行DNA测序。
另外,检测出有5个条带并不代表该菌株所有的个体都含有这5种质粒,同一菌株中可能存在含有不同种类质粒的菌,质粒的拷贝数也不尽相同,如存在F因子的菌株,所以这种“菌株含有5个质粒”的说法是不确切的。
3、在提取的质粒DNA中,含有大量的没有去除干净的RNA,其可能原因是什么?
怎样解决?
在质粒的提取纯化过程中忘记加RNaseA、温度或者PH条件使得RNaseA活力不高,或者反应时间太短RNaseA的反应进行的不充分都可能导致提取的质量DNA中含有大量RNA。
解决方法(包括要注意的问题)如下:
在抽提蛋白前加入足量的RNaseA,在适宜的温度(37℃)下反应足够长的时间(1~2h),RNaseA保存于冰箱中,现用现取;加入RNaseA混合时不要猛烈振荡;算好加入RNaseA的浓度,保证加入后浓度不低于150μg/mL(本次实验采用150μg/mL效果较好)。
4、DNA在琼脂糖凝胶中的电迁移速率的影响因素有哪些?
答:
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与多种因素有关,除了与DNA本身的结构性质有关外,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
①DNA分子大小
电泳时,线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的,其迁移速率与碱基对数目的log值呈反比。
分子越大,迁移时的摩擦阻力越大,迁移速率越慢。
分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。
分子越大,迁移越慢。
②DNA分子构象
相对分子质量相同而构象不同的DNA分子迁移速率也会有区别。
在抽提质粒的过程中,由于各种因素的影响会产生不同构象的DNA如超螺旋共价闭合环状DNA(cccDNA)、线状DNA(LDNA)以及开环DNA(ocDNA)等,一般空间结构紧密的分子泳动速度快(cccDNA>LDNA>ocDNA),但是在条件变化时,构象会有所变化,迁移速度也可能会产生变化。
③琼脂糖浓度:
琼脂糖的浓度直接影响凝胶的孔径,而一定大小的DNA片段在不同宁都德琼脂糖凝胶中的泳动素不同。
通常凝胶浓度越低、凝胶孔径越大、DNA电泳迁移速率越快。
④电泳时的电场电压:
低电压,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增大,不同长度的DNA泳动速率的增加程度不同,不利于DNA的分离。
为了使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm。
⑤电泳缓冲液:
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速率。
当电泳液为去离子水的时候,溶液的导电性少,带点颗粒泳动很慢,DNA几乎不移动;而在高离子强度下,导电性极高,带电颗粒泳动很快,而且会产生大量的热,有时甚至融化凝胶或使DNA变性。
⑥温度:
琼脂糖凝胶电泳时,不同大小的DNA片段的相对电泳迁移率在4~30℃内无变化,因此琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行,而琼脂糖浓度少于0.5%时,应在4℃下进行电泳。
⑦另外如果嵌入染料加在电泳液中,会降低线性DNA迁移率;
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