细胞复苏与冻存.docx

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细胞复苏与冻存

关于细胞复苏

细胞冷冻保存与复苏原理

三木转自体外培养的原理和技术.薛庆善主编.2001年2月.科学出版社,pp128-136

细胞冷冻保存与复苏原理

在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。

因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。

当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。

所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。

而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。

不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。

如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。

这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。

如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。

如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。

这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。

当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。

但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。

因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。

在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。

冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。

而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。

细胞在冷冻过程中会发生如下变化：

当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。

细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。

其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。

冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：

如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。

Luyet（1973）证实液体的凝固可分为两种形式：

一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。

不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。

当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。

同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。

当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。

超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。

细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。

不同细胞的最适冷冻速率不同。

小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.

60C/min、70C/min和2000C/min。

细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。

冷冻保存温度

冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。

不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。

但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是目前最佳的冷冻保存温度。

在-1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。

如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。

应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。

在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。

复苏速率

冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。

复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。

复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。

一般来说，复温速度越快越好。

常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。

复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。

复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。

冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。

冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。

一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。

但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。

例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。

渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。

甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。

目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。

所以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40～60分钟。

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。

其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。

目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。

由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。

冷冻保存方法

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。

非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。

以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。

玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。

以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。

但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。

非玻璃化冻存方法

下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

主要材料

（1）仪器设备：

普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

（2）冻存管：

容量为1ml或1.5ml；

（3）冷冻保护液：

一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。

现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。

使用前，于室温下水浴溶解；

（4）待冻存细胞：

各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。

操作过程

1.待冻存细胞悬液的制备

（1）按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；

（2）将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

（3）向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；

（4）按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；

（5）再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2.分级冷冻

（1）先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；

（2）接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；

（3）将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；

（4）然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；

（5）最后将冻存管投入液氮保存。

3.记录

做好冻存记录。

记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。

高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。

在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。

若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。

操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。

既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。

另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。

因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

玻璃化冻存方法

以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashietal.1986）。

主要材料

（1）冷冻保护液：

为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr8000）而成。

用2mol/LNaOH调节pH至7.4，现配现用。

（2）冻存管：

SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；

（3）设备：

液氮储存罐；

（4）待冻存细胞：

人类外周血单核细胞。

冻存过程

（1）用常规方法分离全血中单核细胞；

（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；

（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；

（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。

滴加过程为：

前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。

2×107个细胞要滴加15ml冻存液。

滴加的时间在15min左右。

最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；

（5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；

（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。

12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；

（7）将冻存管两端以火焰封口；

（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。

降温速度约为6000C/min。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。

目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。

这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在40C时毒性大为减弱）。

所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。

另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。

冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法

主要材料

（1）仪器设备：

恒温水浴箱、高速离心机；

（2）培养用液：

完全培养液。

复苏过程

（1）调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；

（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；

（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；

（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。

实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashietal.1986）。

主要材料

（1）设备：

高速离心机；

（2）培养用液：

添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

操作过程

（1）将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。

复温速率约5600C/min。

一次可以进行多个冻存管的复苏；

（2）将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

（3）沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。

前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。

全过程约为65min，都在冰浴中进行；

（4）将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。

向细胞沉淀中加入培养液重

新悬浮细胞，用于培养。

结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。

稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。

关于"细胞的冰冻和复苏"

huyanhui细胞的冻存和复苏

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。

5、将冻存管口封严。

如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：

室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：

操作时应小心，以免液氮冻伤。

液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。

使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材

器材：

液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等

试剂：

0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）

附：

冻存液配制：

培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。

保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。

配好后4℃下保存。

kwzy１．冻存时，可以直接将装有细胞的冻存管放到液氮中．效果非常好．

２．复苏时可省略步骤５．将上清夜吸干净后，直接用适当的培养液将细胞转到培养瓶或培养板（细胞数量少的情况下）中。

gdognchun我感觉只要DMSO的浓度保持在10％就可以了，血清的浓度影响不是很大的。

我曾经用90％的血清＋10％的DMSO也用过50％DMEM+40%血清＋10％DMSO冻存细胞，复苏后细胞都能成活。

并且我是在细胞离心后用冻存液悬浮后，分装到冻存管中-80度过夜，后直接存放于液氮中。

antitrust细胞冻存时要计数，但发现实验室里很少有人做！

请问大家计数有什么呀？

hz_kirk不用液氮，在—110度的冰箱中行不行？

multibliss血清

1.血清必须贮存于-20℃～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。

如果一次无法用完一瓶，可将其40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10％，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。

若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装（500ml）血清解冻步骤（逐步解冻法）：

-20℃或-70℃®4℃冰箱溶解一天®室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。

在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沈淀的发生。

勿直接由-20℃®37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。

加热过程中须规则摇晃均匀。

此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之质量。

补体参与之反应有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。

5.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之质量。

6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：

发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之质量。

若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。

不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。

6.2.显微镜下观察之“小黑点”：

通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。

有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。

一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之质量，应立即停用，更换另一批号的血清。

7.血清之生长测试

7.1.材料：

7.1.1.MDCKcell（ATCCCCL-34或CCRC60004）

7.1.2.αMEM（alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022）

7.1.3.6-wellTCplate（or35mmTCdish）

7.1.4.methanol

7.1.5.glacialaceticacid

7.1.6.10%Giemsasolution（GibcoBRL10092-013）

7.2.步骤：

7.2.1.以αMEMwith10%FBS（已测试过）培养MDCK细胞于T75flask至80%confluency。

7.2.2.以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之αMEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。

以不加血清之αMEM稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ml。

7.2.3.将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入1ml含不同浓度的血清（20%,10%,4%,2%,1%,0.4%）之αMEM，使血清最终浓度为10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。

用已测试过之血清同时进行对照组试验。

7.2.4.37℃，5%CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。

7.2.5.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液（甲醇：

冰醋酸﹦3：

1），室温下静置10min。

7.2.6.去除固定液，水洗二次。

7.2.7.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

7.2.8.去除染液，水洗二次。

7.2.9.以肉眼计数群落数

7.2.10.计算SPE（SerumPlatingEfficiency）：

SPE=（no.ofcolonies/well）/100x100%

7.2.11.计算RPE