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专业实习报告
—南通大学生物技术专业
班级:
生物技术112
姓名:
孔月
学号:
1109051054
实习报告
目录
一序言1
二实习目标2
三公司简介2
四内容3
4.1CIK细胞制备培养与研究3
4.2培养原理5
4.3细胞制备6
4.4步骤简图与推荐试剂8
五实习体会9
一.序言
毕业实习是大学生大学学习阶段的重要实践环节,它是与今后的职业生活最直接联系的,我们学生在生产实习过程中将完成学习到就业的过渡,因此实习活动是培养技能型人才,实现培养目标的主要途径。
它不仅是校内教学的延续,而且是校内教学的总结。
可以说,没有生产实习,就没有完整的教育。
作为新世纪的大学生,在注重理论知识学习的前提下,首先要提高生产实习管理的质量。
生产实习教育教学的成功与否,关系到学校的兴衰及我们的就业前途,也间接地影响到现代化建设。
我于2014.7.3--2014.8.30到南通市科尔生物科技有限公司实习,收获颇丰。
2.见习目标
1、通过深入各实习岗位进行综合性的实习,将所学的基础理论、基础知识和基本技能运用于实践之中,将所学的知识转化为能力,培养实际工作能力、科研能力。
2、掌握现代生物技术手段与运用能力,训练实际操作技能。
3、了解校外科研机构的实际工作情况,尤其是与所学专业相关的学科如生物学、化学、医学药学等学科的研究情况和前沿状况。
4、从实际出发,检验自己在态度、知识、能力、技能等四项指标方面所达到的程度。
5、了解CIK细胞培养及作用原理。
6、熟练掌握细胞培养的各项操作技能,并注意观察与记录。
7、积极交流,开阔专业视野,并做好实验室卫生打扫。
三、公司简介
南通科尔生物技术有限公司位于南通市太阳鑫城大厦2幢156室,主要提供生物技术的研发,化妆品,防护用品,生化试剂(不含化学危险品和有毒品)的研发,销售等产品和服务。
4、内容
4.1CIK细胞培养制备与研究
CIK细胞,即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller,CIK)是一种新型的免疫活性细胞,CIK增殖能力强,细胞毒作用强,具有一定的免疫特性。
由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性,和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强,如同“细胞导弹”,能精确“点射”肿瘤细胞,但不会伤及“无辜”的正常细胞。
尤其对手术后或放化疗后患者效果显著,能消除残留微小的转移病灶,防止癌细胞扩散和复发,提高机体免疫力,因此,CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
4.1.1CIK细胞特点:
1、增殖能力强,主要效用细胞CD3+CD56+可增殖1000倍;
2、杀伤活力强,远优于传统的LAK细胞和细胞因子γ干扰素、白细胞介素2等;
3、杀瘤谱广,不受MHC限制,具有广谱杀肿瘤和病毒的作用,对多重耐药肿瘤细胞仍敏感,杀瘤活性不受环孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂的影响,能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。
4、毒副作用小,无严重不良反应。
4.1.2CIK细胞治疗技术的优势:
1、可有清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶,预防肿瘤的复发和转移;
2、可与放、化疗联合使用,能降低放化疗的毒副作用的感染率,提高放化疗的疗效;
3、可用于放、化疗无效的患者,或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗;
4、对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者,能迅速缓解其临床症状,延长生存期;大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果;
5、由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用,在治疗肿瘤的同时,大部分患者尤其是放化疗后的患者,可出现消化道症状减轻或消失,皮肤有光泽,黑斑淡化,静脉曲张消失,脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现,及精神状态或体力明显恢复等现象,从而提高肿瘤患者的生存质量,延长生存期。
4.2培养原理
CIK培养用细胞因子和抗体:
4.2.1nCD3激发型单抗:
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体,即T细胞抗原受体(Tcellantigenreceptor,TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合,也就是T细胞对抗原的特异性识别。
TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体,在T细胞表面,其与CD3分子通过非共价键结合,形成TCR/CD3复合体。
TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集,进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,Fyn和ZAP-70等),促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。
磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白,从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等),最终通过激活转录因子,使其进入细胞核内,结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等),引起基因的表达和转录,T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
由上可见,CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。
CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后,可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化,进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活,从而使T细胞增殖和活化。
也就是说,CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程,从而引起T细胞的增殖与活化,因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
此外,CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。
研究表明,仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖,而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。
因此,在进行CIK培养时,最好选用OKT-3克隆,以保证每个患者的T细胞均能被激活。
4.2.2nIL-2(白细胞介素-2)
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCGF),是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。
IL-2既是自分泌细胞因子,也是旁分泌细胞因子,其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化,并进入细胞分裂状态。
此外,IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。
因此CIK细胞培养中须添加IL-2,以促进T细胞的增殖与活化。
4.2.3nIFN-g(干扰素-g)
IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用,因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。
在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g,可降低IL-2的用量。
研究发现,IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。
先加入IFN-g,培养24后再加入IL-2,可明显提高CIK的细胞毒活性。
4.2.4nIL-1a(白细胞介素-1a)
IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。
当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时,可以明显提高CIK的细胞毒作用。
4.3细胞制备
4.3.1细胞采集
①外周血单个核细胞的采集
②用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL;
③淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC);
④无血清培养液洗涤2次,获得纯度在90%以上的PBMC。
4.3.2CIK细胞的培养及鉴定
①将PBMC按1-2x106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中,加入1,000U/ml的重组人IFN-g,37oC,5%CO2培养箱中培养;
②24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2,刺激CIK细胞的生长和增殖;
注:
此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-1a。
③每3天半量换液或扩瓶一次,并补加重组人IL-2300U/ml;
④在培养的第14d,收获CIK细胞。
4.3.3CIK细胞质控:
①台盼蓝染色检测:
活细胞应在80%以上;
②流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达:
CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
③细胞杀伤实验:
以CIK细胞为效应细胞,以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞,将效应细胞与靶细胞按10:
1(数目比)的比例加入96孔U型板中,每孔含靶细胞1x104个,终体积为200ml,设3个复孔。
培养4h,然后取培养上清,用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
④收获细胞前,取少量培养物进行细菌、真菌培养,并检测支原体、衣原体,及内毒素(标准:
病原学检测阴性,内毒素<5Eu)。
4.4步骤简图及推荐试剂
5、实习体会
通过此次实习,让我学到了很多课堂上更本学不到的东西,仿佛自己一下子成熟了,懂得了做人做事的道理,也懂得了学习的意义,时间的宝贵,人生的真谛。
明白人世间一生不可能都是一帆风顺的,只要勇敢去面对人生中的每个驿站!
这让我清楚地感到了自己肩上的重任,看清了自己的人生方向,也让我认识到了科研工作应支持仔细认真的工作态度,要有一种平和的心态和不耻下问的精神,不管遇到什么事都要总代表地去思考,多听别人的建议,不要太过急燥,要对自己所做事去负责,不要轻易的去承诺,承诺了就要努力去兑现。
单位也培养了我的实际动手能力,增加了实际的操作经验,对实际的研究工作的有了一个新的开始,更好地为我们今后的工作积累经验。
我知道工作是一项热情的事业,并且要持之以恒的品质精神和吃苦耐劳的品质。
我觉得重要的是在这段实习期间里,我第一次真正的融入了社会,在实践中了解社会掌握了一些与人交往的技能,并且在次期间,我注意观察了前辈是怎样与上级交往,怎样处理之间的关系。
利用这次难得的机会,也打开了视野,增长了见识,为我们以后进一步走向社会打下坚实的基础。
非常感谢学校能提供这次的实习机会,也很感谢刘东老师在我整个实习期间对我的悉心指导,让我学到了很多,受益匪浅。
实习期间,我从未出现无故缺勤。
我勤奋好学.谦虚谨慎,认真听取老同志的指导,对于别人提出的工作建议虚心听取。
并能够仔细观察、切身体验、独立思考、综合分析,并努力学到把学样学到的知道应用到实际工作中,尽力做到理论和实际相结合的最佳状态,培养了我执着的敬业精神和勤奋踏实的工作作风。
也培养了我的耐心和素质。
能够做到服从指挥,与同事友好相处,尊重领导,工作认真负责,责任心强,能保质保量完成工作任务。
并始终坚持一条原则:
要么不做,要做就要做最好。
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