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生化工程
绪论
一、生化工程的概念
biochemicalengineering
生化工程的定义:
将生物技术的实验室成果经工艺及工程开发,成为可供工业生产的工艺过程,常称为生化工程。
生物工程的重要组成部分,包括底物或营养液的准备、预处理、转化以及产品的分离、精制等工程和工艺问题。
一般把发酵工程、动植物细胞的大规模培养、酶工程、生化反应工程、生物分离工程(下游工程)、生物功能元件(如酶电极)以及生物过程中的控制和优化都包括在生化工程之内。
二、生化工程的由来
20世纪40年代,第二次世界大战中青霉素大规模工业化生产而诞生了生化工程。
美国科学家盖顿关于通风搅拌传质的论文,作为生化工程的诞生标志。
1959年生化工程杂志Biotech&Bioengineering创刊。
1965年出现第一本生化工程的书Biochemicalengineering。
三、生化工程的特点
1.以生物活细胞或由细胞提取出来的酶为催化剂生物化学反应过程。
2.生物反应过程通常在温和的条件下进行,但影响因素多。
3.生化反应器复杂,控制参数众多。
四、生化工程研究的内容
生化工程是一门边缘交叉学科,研究的内容非常丰富。
生化工程按所处理的对象分为微生物生化工程、植物生化工程、动物生化工程和酶生化工程。
生化工程内容按对细胞处理的方式大致分胞外控制部分和胞内控制部分两大部分。
胞外控制部分包括:
培养基的灭菌、通气搅拌、固定化技术、空气除菌、比拟放大、产品分离和纯化、发酵动力学、发酵优化控制和细胞培养技术等。
胞内控制部分包括:
遗传育种、代谢控制、培养基平衡等。
五、生化工程的发展
两大跃变
第一次跃变:
20世纪40年代抗生素的深层发酵的实现。
第二次跃变:
20世纪70年代后期分子生物学和遗传学的发展。
六、今后生化工程重点发展的四个方面
1.新型生物反应器的研究开发,特别是针对基因工程产品和动、植物细胞培养的产品的投产研制新型生物反应器。
重点在于生物安全。
植物细胞对剪切力和环境敏感以及培养周期长而防止污染的问题。
动物细胞的附壁生长的特点。
2.新型分离方法和设备的研发,特别是针对蛋白质、多肽产品的分离。
3.各种描述生物反应过程的数学模型的建立,将有利于过程的控制和优化以及计算机的应用。
4.生物反应器内重要参数的传感器的研制和有关计算机控制系统硬件及软件的建立和完善。
七、生化工程的应用
1.医药工业
主要生产人体或动物体内调节生理作用的药物。
如:
激素、胰岛素、抗生素、干扰素、维生素以及一些高效药物(TPA等)
2.食品工业
传统的调味及发酵食品、醇类饮料、有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、甜味剂、鲜味剂等。
3.化工、冶金工业
生产许多化工原料,有甲醇、乙醇、丁醇、柠檬酸、水杨酸、长链二元酸、丙酮、甘油还有使用微生物合成聚羟基丁酸(PHB)塑料和聚羟基脂肪酸酯(PHA)。
4.能源、环保
微生物发酵生产甲烷等可再生能源。
利用微生物处理污水。
八、我国生化工程研究现状
我国生化工程研究起步较晚,但发展很快。
初期只涉及生化反应器及反应动力学的研究,现已扩展到分离工程、动植物细胞培养及生物传感器及过程控制的研究。
2.5L、5L、10L自控发酵罐已研制成功,计算机在线控制青霉素生产过程。
工业微生物学基础
一、微生物的特点
体积小,比表面积大
种类多,分布广
生长旺盛,繁殖快
适应强,易变异
细胞是生物的基本单位,其结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、其他
生物按细胞结构分类:
非细胞生物(病毒、类病毒等);原核生物(细菌、放线菌等);真核生物(酵母、霉菌、动植物等)
原核和真核细胞是细胞进化中的两个层次,二者的主要区别是原核细胞无核仁核膜和细胞内膜结构。
二、工业生产常用的微生物
用于大规模发酵生产的菌种应该符合以下基本要求:
(1)生长繁殖能力强,在较短的发酵周期内即可产生大量有价值的发酵产物。
Highyield
(2)发酵培养基应价格低廉、来源充足、被转化为产品的效率高。
Cheapmedium
(3)发酵副产物少,产品相对容易分离。
Lessby-products
(4)培养条件易于控制,并具有抗噬菌体感染的能力。
Easytocontrol
(5)遗传特性稳定,不易变异和退化。
Stabilityofmicroorganism
(6)对人、动植物和环境不应造成危害。
Harmless/environmentallyfriendly
目前育种总的趋势:
从野生菌转向变异菌
自然选育转向代谢育种
从诱发基因突变转向基因重组
由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入,藻类和病毒等也正在逐步变为工业生产用的生物。
尽管如此,目前人们对微生物的认识还是十分不够的,已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%。
微生物的代谢产物据统计已超过1300多种,而大规模生产的不超过100多种。
微生物酶有近千种,而在工业上利用的不过四五十种,潜力巨大。
在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。
细菌(bacteria)属于单细胞原核生物(unicellularprokaryote),以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。
工业生产常用的细菌有:
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸杆菌(Lactobacilluslactics)、醋酸杆菌(Acetobacter)、棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium),用于生产淀粉酶(amylase)、蛋白酶(proteinase)、乳酸(lacticacid)、醋酸(aceticacid)、氨基酸(aminoacid)、肌苷酸(inosinicacid)。
酵母菌(yeast)为单细胞真核生物(unicellulareukaryote),在自然界中普遍存在,主要分布于含糖质较多的酸性环境中,如水果、蔬菜和植物叶子上,以及果园土壤中。
工业上常用的酵母菌有:
啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等,用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、
病毒(virus)其特点如下:
1.形体微小,体积比细菌小的多。
2.没有细胞结构,是一种独特分子的生物,主要由核酸和蛋白质构成。
3.营寄生生活,由于缺乏独立代谢的酶体系,不能脱离寄主而自行生长繁殖,有专一性。
三、微生物菌种的分离、选育与保藏
1.微生物菌种的分离spawnisolation
发酵工业获得生产菌株的途径主要有:
(1)从自然界分离筛选;
(2)向菌种保藏中心、各实验室索取或购置菌株,从中筛选;(3)直接购置专利菌种或向生产单位购置优良生产菌种。
从自然界分离新菌种一般步骤:
采样——富集——分离——筛选
(1)采样collection
定义:
根据微生物的生态特点从自然界取样分离所需菌种的过程。
采样方式一般是除去表土,取离地面5-15cm处的土样。
(并非定律)
根据微生物营养类型和生理特点确定采样地点:
饭店肉类加工厂——蛋白酶和脂肪酶产生菌;
糕点面粉加工厂——淀粉酶产生菌;
枯枝落叶烂木头——纤维素酶产生菌;
蜂蜜甜果植物汁——酵母菌;
腐烂果蔬果园土——果胶酶产生菌;
温泉堆肥火山灰——高温菌;
(2)富集enrichment
控制营养成分:
淀粉(葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨不合适)为唯一碳源——产淀粉酶的微生物
控制培养条件:
通过热处理较易分离到产芽孢的细菌(将样品经80℃水浴处理10min左右)
使用抑制剂:
青霉素——抑制细菌和放线菌;放线酮——抑制酵母菌和霉菌。
(3)分离isolation
常规分离法:
倾注平板分离法、涂布平板分离法、平板划线分离法(最为常用)和组织分离法
平皿生化反应分离法:
利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。
分离培养基根据目的菌特殊的生理特性或代谢产物来设计。
如:
平皿生化反应分离法
目的微生物
分离培养基
透明圈法
淀粉酶产生菌
淀粉+碘液
变色圈法
果胶酶产生菌
果胶+0.2%刚果红溶液
抑菌圈法
抗生素产生菌
工具菌:
抗生素敏感菌
生长圈法
氨基酸、核苷酸和维生素等的产生菌
工具菌:
某生长因子的营养缺陷型菌株
(4)筛选screening
举例:
α-淀粉酶产生菌的筛选。
2.诱变育种mutationbreeding
变异(variation)又称突变(mutation),是育种的基础。
●自然突变(naturalmutation):
突变频率很小
●诱发突变(inducedmutation):
提高突变频率
诱变育种的概念:
P17中间段
诱变育种的步骤和方法:
(1)出发菌株的选择original/statingstrain
应挑选对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。
用作诱变育种的出发菌株常从以下3类菌株中选取:
●自然界新分离的野生型菌株;
●生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株;
●每次诱变处理都有一定提高的菌株。
(2)单细胞菌悬液的制备bacterialsuspension
目的是为了使出发菌株细胞均匀地接触诱变剂。
菌悬液的制备应注意以下几点:
●新培养的细胞,生理状态同步,处于旺盛的对数期;
●菌悬液细胞处于良好的分散状态;
●菌悬液的浓度要适当;
●选择合适的介质(生理盐水或缓冲液)。
(3)诱变剂及其剂量的选择mutagen
诱变剂主要是指某些能引起生物细胞DNA结构改变的物理或化学因子,其作用是提高变异频率、扩大变异幅度、改变产量。
常用的诱变剂mutagen
●物理诱变剂:
紫外线、X射线、γ射线、快中子、离子束等
●化学诱变剂:
碱基类似物:
5-溴尿嘧啶(BU)
烷化剂:
甲基磺酸乙酯(EMS);亚硝基胍(NTG)
移码诱变剂:
溴化乙锭、吖啶类化合物
脱氨剂:
亚硝酸
羟化剂:
羟胺
金属盐类:
氯化锂、硫酸锰
●生物诱变剂:
噬菌体、转座子
近期研究发现,较低剂量比较容易出现正突变菌株。
(4)诱变剂处理方式treatmentmethod
单一诱变剂处理——复合诱变剂处理
单一诱变剂处理可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病,使得筛选工作趋向简单化。
缺点是突变率比复合诱变剂处理要低,突变类型较少。
复合诱变剂处理容易得到更多的突变类型,能导致较大的突变。
(5)突变株的分离与筛选isolationandscreening
微生物通过诱变处理,群体中产生各种类型的突变体,有正突变型、负突变型和稳定型。
抗性突变株或营养缺陷型突变株,常用选择培养基进行筛选。
高产突变株的筛选较难。
3.原生质体融合技术protoplastfusion
概念:
P17最后一行
原生质体融合可发生在:
不同种属的细胞之间、非生殖细胞之间、2个以上细胞融合
原生质体融合的主要步骤:
P18第3段
原生质体融合进行基因重组的优点:
P18第4段
4.菌种保藏spawnpreservation
目的:
使菌种的生长代谢活动尽可能降低,以减少其变异。
手段:
保持培养基营养成分在最低水平,缺氧、干燥、低温、避光
保藏方法:
方法
措施
保存期
优缺点
斜面冰箱保藏法
斜面,4℃冰箱低温保存
3-6个月
简便;短期过渡
沙土管保藏法
沙土,干燥+真空+冰箱
数年
简便,长期
石蜡油封存法
斜面+石蜡油,低温缺氧
数年
简便,长期
真空干燥冷冻保藏法
低温+干燥+缺氧
5-15年
效果好,广泛适用;设备、要求严格
液氮超低温保藏法
-196℃
>20年
适用范围广,保存期最长;费用高
微生物的营养
微生物的营养(nutrition)是指微生物从环境获得它们合成自身的细胞物质和提供机体进行各种生理活动所需的能量,以及形成代谢产物所需的营养物质的全过程。
一、微生物的营养类型
根据碳源不同,分为自养微生物(autotrophicmicroorganism)和异养微生物(heterotrophicmicroorganism);根据所需能量不同,分为光能营养(phototrophy)型和化能营养(chemotrophy)型。
上述营养型的分类并非绝对,在自养和异养、光能型和化能型之间都存在中间过渡类型,成为兼性营养型。
比如:
氢细菌可以利用氢和CO2进行自养生活,也可以直接利用有机物进行异养生活;红螺菌既可利用光能又可利用化能。
微生物的营养类型之间没有绝对的界限。
二、微生物的营养基质
(一)碳源(carbonsource)
碳源主要是碳水化合物,如葡萄糖、糖蜜、蔗糖、淀粉等。
葡萄糖:
活性碳源,微生物可以直接吸收利用。
淀粉:
惰性碳源,先要经过微生物酶水解形成单糖才能被吸收利用。
常用的淀粉原料有玉米、土豆、麸皮、米糠等,近年来木薯在发酵工业上广泛用于生产酒精、柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸等。
糖蜜是制糖生产的副产品,含有丰富的糖、含氮化合物、无机盐和维生素等,物美价廉,是发酵工业常用的原料。
近年来,醇类、有机酸、石油烷烃也常被用作碳源来发酵生产一些特殊产品。
比如用烷烃或脂肪酸发酵生产化工原料长链二元酸。
(二)氮源(nitrogensource)
有机氮源:
花生饼、豆饼、棉籽饼、菜籽饼、玉米浆、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、蚕蛹、酒糟、米糠等。
提供蛋白质、多肽、游离氨基酸,少量糖类、脂肪、无机盐、维生素和某些生长因子。
无机氮源:
铵盐、硝酸盐、尿素、氨水等,与有机氮源配合使用往往效果更好。
分子态氮:
固氮微生物。
(三)无机元素(inorganicelement)
主要功能:
(1)构成菌体的组成成分;
(2)作为酶活性基团的组成部分;(3)调节微生物体内的pH和氧化还原电位;(4)某些自养菌的能源。
6种主要元素:
C、H、O、N、P、S
大量元素:
C、H、O、N、P、S、K、Mg、Ca、Fe
微量元素:
Mn、Co、Cu、Zn、Ni等
(四)生长因子(growthfactor)
微生物生长发育过程中不可缺少而需要量极少的一类特殊营养物质,包括维生素、氨基酸、核苷酸等,以辅酶或辅基的形式参与菌体生长发育过程的酶促反应。
许多天然碳源、氮源,比如玉米浆、麸皮、麦糠等含有丰富的生长因子。
三、微生物的培养基(culturemedium)
培养基:
人工配制的适于微生物生长繁殖或累积代谢产物的营养基质。
(一)按物理状态分类
1.固体培养基(solidmedium)
麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉+无机盐+水——白酒厂、酿造厂等生产用
溶解的培养液+胶凝剂(琼脂、明胶等)——实验室用
2.半固体培养基(semisolidmedium)
半固体培养基是在培养液中加入少量的凝固剂(如0.2%~0.5%的琼脂)。
这种培养基常用于观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定等。
3.液体培养基(liquidmedium)
把培养基成分溶解或悬浮在水中而进行液体培养的培养基。
广泛用于微生物的培养、研究和大规模生产。
(二)按营养物质的来源分类
天然培养基(complexmedium):
动植物组织或微生物的浸出物、水解液等,如蛋白胨、牛肉膏、麦芽汁、马铃薯、玉米粉、米糠、豆饼粉等。
合成培养基(syntheticmedium):
由已知化学成分及数量的化学药品配制而成,适合于定性定量的研究工作。
半合成培养基(semi-syntheticmedium):
在天然培养基的基础上,适当添加一些化学药品,补充无机盐等不足,使之更能充分满足微生物对营养的需要。
在实验室和生产中使用最多。
(三)按用途分类
基础培养基(basicmedium)含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质,可供大多数细菌生长
鉴别培养基(differentialmedium)在培养基中加入某种试剂或化学药品,使培养后会发生某种变化,从而区别不同类型的微生物。
例如:
伊红美蓝乳糖培养基(EMB培养基,Eosin-methylenebluemedium)用于检测水中的大肠杆菌污染。
加富培养基(enrichedmedium)有利于某种微生物而不利于其它微生物生长而设计的培养基。
选择培养基(selectedmedium)在培养基中加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长而保证需要菌的生长,从而在混杂的微生物中选出需要的菌种。
配制培养基的原则:
(1)目的明确:
实验or生产?
菌种的营养类型?
(2)营养协调:
特别是C :
N
(3)条件适宜:
pH、渗透压等
(4)经济节约:
尽量选用容易获得、价格低廉的原料作为培养基成分
四、微生物对营养物质的吸收
●被动吸收:
又称单纯扩散,通过滤过、渗透、简单扩散和易化扩散(需要载体)等几种形式,将营养物质吸收进入细胞内。
这种吸收形式不需要消耗能量。
一些分子量低的物质,如简单多肽、各种离子、电解质和水等的吸收即为被动吸收。
●主动吸收:
又称主动运输,必须通过机体消耗能量,依靠细胞载体蛋白来完成的一种逆浓度梯度的物质转运形式。
是细胞吸收营养物质的主要机制。
被动吸收和主动吸收主要区别有两点:
主动运输需要能量和载体,可以跨浓度梯度运输。
被动吸收有滤过、渗透、简单扩散和易化扩散,除易化扩散外都不需要载体,但都是顺浓度梯度运输,即靠渗透压来运输,但都不消耗能量。
五、影响微生物生长发育的因素
1.温度
微生物的生长实际上可以看做是生物体的一系列生物化学反应的有机组合,温度是这些反应的必须条件。
最适温度是一个相对的概念,最适生长温度未必最适合微生物的生物合成,反之亦然。
2.pH
一般霉菌、酵母最适pH为3~5,细菌、放线菌6.5~8。
不同生长阶段要求pH值不同,过程中pH值会发生改变(变酸为主),改变的原因是:
3.通气(aeration)与搅拌(agitation/stirring)
根据微生物对氧的需求不同,可将其分为3类:
●好氧微生物:
工业发酵中应用最多
●厌氧微生物:
分子态氧对其有毒害作用,如丙酮-丁醇产生菌
●兼性微生物:
酵母菌有氧生长繁殖,无氧发酵产生酒精
发酵过程中通气一般前少后多
搅拌能打碎气泡,增加气液接触面积,加速氧的溶解,提高空气利用率,促进微生物的繁殖,但过度剧烈的搅拌会导致培养液产生大量气泡,增加污染杂菌的机会。
4.基质浓度
菌体生长速率是基质浓度的函数,常用Monod方程来描述菌体生长速率与基质浓度的关系:
微生物的培养
微生物培养的目的:
●以菌体为产品(如酵母、SCP的生产)
●以酶为产品(酶制剂生产)
●除去某物(污染治理)
●获得代谢产物(酒精、柠檬酸、味精等的生产)
●特定的转化反应(酒精转化为醋的生产)
一、微生物的培养方法
(一)固体培养
设备简单,适于小规模生产,但劳动强度大,产品质量不太稳定。
近年来固体培养有新的发展,如用于酒精发酵等大工业生产中的厚层通风发酵。
(二)液体深层培养
生产效率高,便于控制、适于机械化和自动化,是当前微生物发酵工业中的主要生产方式。
(三)载体培养
以天然或合成多孔材料为微生物生长的载体。
此法兼备固体与液体培养的优点。
载体可反复使用。
从不同的角度也可将培养方法分为
●静置培养——适于厌氧发酵
●通气培养——适于好氧发酵
●分批培养(batchculture)
●连续培养
●半连续培养
二、微生物的分批培养
典型的微生物分批培养工艺流程图(P30图2-13)
(一)种子扩大培养
目的在于提高发酵罐的生产率。
作为种子必须具备下列条件:
生长繁殖快;接种量适宜;生理状态稳定;无杂菌;保持稳定的生产能力。
1.种子制备的工艺流程
P31图2-14
2.种子罐的级数
指制备种子需逐级扩大培养的次数,根据种子的生长繁殖速度而定。
谷氨酸等氨基酸发酵所用菌种是细菌,生长繁殖速度很快,常采用一级种子罐扩大培养,称二级发酵,即将种子接入种子罐中扩大培养后移入发酵罐;抗生素的生产中,放线菌的生长繁殖速度较慢,常采用二级种子扩大培养,也称三级发酵。
一般50m3以上的发酵罐都采用三级甚至四级发酵。
3.种龄和接种量
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
通常以对数生长期为宜。
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
大多数抗生素发酵的最适接种量为7-15%,棒杆菌生产谷氨酸发酵中的接种量只需1%。
采用较大的接种量可以缩短发酵周期,但也不宜过大,因为种子培养费时,且过多的代谢废物会影响正常发酵。
(二)微生物群体的生长规律
微生物典型生长曲线P32图2-15
微生物分批培养时的生长曲线,代表了微生物在新的适宜环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化,根据微生物生长繁殖速率不同,可将生长曲线大致分为延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期4个阶段。
1.延滞期(lagphase)
接种后,细胞往往并不立即生长繁殖,其细胞数在一定时间内无明显增加,这一阶段称为延滞期(又称调整期或适应期)。
发酵工业中缩短延滞期的措施:
使用对数期微生物进行扩大培养;增大接种量;在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分,使菌种加快对发酵过程的适应。
2.对数生长期(logphase)
细胞数目呈几何级数增加,也成为指数期。
N2=N1×2n
繁殖代数n=(lgN2-lgN1)/lg2
世代时间τ=(t2-t1)lg2/(lgN2-lgN1)
生长速率R=n/(t2-t1)=1/τ
对数期是发酵生产中种子的最佳种龄期。
3.稳定期(stationaryphase)
细胞总数处于动态平衡,在数量上处于最高峰,为最佳收获期,生长速率为零。
许多发酵产品主要在此阶段形成和积累。
生产中常采用补充营养物质和调整pH等措施,延长稳定器,提高代谢产物的产量。
4.衰亡期(declinephase)
营养成分耗尽,代谢产物大量积累,死亡的细胞数增多,活细胞数显著下降,生长速率为负。
大多数分批培养都在进入衰亡期前结束。
三、微生物的连续培养(continuousculture)
在微生物培养中不断放出培养液,同时补充等量的新鲜培养基,保持微生物恒定的培养条件,有效延长对数期到稳定期的阶段,使微生物的生长代谢处于恒定状态,从而达到增加产量的目的。
(一)单级连续培养
1.物料衡算
0+μcxV–Fcx=V·dcx/dt
加入生长流出积累
式中μ——菌体的生长比速率,h-1;
cx——反应器中的菌体浓度,g/L;
V——反应器中培养液体积,L;
F——培养基流入流量或培养液流出流量,L/h。
μ=F/V=D
式中D——流量F与培养液体积之比,称为稀释率,表示单位体积培养液的流加量,量纲为[时间]-1,即培养液在反应器内平均停留时间的倒数。
生长比速率是微生物的特性,在分批培养中无法控制,但在连续培养中只要通过改变流量F,就可以改变稀释率,从而改变菌体的生长比速率。
对限制性基质进行物料衡算:
Fcs0–Fcs–μcxV/Yx/s=V·dcs/dt
流入流出生长消耗积累
式中cs0——加料中限制性基质浓度,g/L;
cs——反应器中的限制性基质浓度,g/L;
Yx/s——对限制性基质的菌体得率系数,其定义为Yx/s=⊿cx/⊿cs
在稳态时,cx=Yx/s(cs0-cs)
2.过程分析
找出系统内底物浓度、菌体浓度
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