卷柏提取物改善高脂血症大鼠肝脏脂肪变及肝脏保护作用的实验研究精.docx
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卷柏提取物改善高脂血症大鼠肝脏脂肪变及肝脏保护作用的实验研究精
ChineseJournalofNewDrugs2010,19(14
)
·重大新药创制专项巡礼·
卷柏提取物改善高脂血症大鼠肝脏脂肪变及
肝脏保护作用的实验研究
郑晓珂1,2,张 鑫,王小兰21,2,侯庆伟,陈克宇,王彦志221,2
(1河南中医学院,郑州450008;2河南省中药开发工程技术研究中心,郑州450008)
[摘要] 目的:
采用高脂饲料喂养法建立大鼠高脂血症模型,研究卷柏提取部位(A,B,C,D)对此大鼠模型肝脏的影响。
方法:
健康雄性Wistar大鼠70只,除正常对照组10只大鼠给予基础饲料外,其余均给予高脂饲料喂养,4周后尾部采血,测量血液中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)的含量。
根据TC值将大鼠随机分为模型组、阳性对照组、卷柏A组、卷柏B组、卷柏C组和卷柏D组(n=10)。
连续给药16周后处死,给药的同时给予高脂饲料。
计算大鼠的体重增长情况和肝脏指数,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肝脏中TC,TG,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、脂联素(APN)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、极低密度脂蛋白(VLDL)的水平。
结果:
给药16周后,卷柏A组和D组的ALT,AST,TC,TG,TNF-α水平均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01),APN,VLDL水平均显著高于模型组(P<0.05,P<0.01),并且D组用药量明显低于A组,相当于A组用药量的1/4。
结论:
卷柏提取物对高脂血症大鼠肝脏有一定的调节作用,能降低脂肪在肝脏中积聚,有保护肝脏的作用。
卷柏提取物减少脂肪在肝脏中积聚、改善肝脏脂肪变的作用可能与其提高肝脏中VLDL水平有关;卷柏提取部位D可能是其主要活性部位。
[关键词] 卷柏提取物;高脂血症;肝脏脂肪变;肝脏保护
[中图分类号]R282.71 [文献标志码]A [文章编号]1003-3734(2010)14-1216-06
EffectofSelaginellatamariscina(Beauv.)Springextractonhepaticsteatosis
anditshepatoprotectiveeffectinratswithhyperlipemia
ZHENGXiao-ke,ZHANGXin,WANGXiao-lan,HOUQing-wei,CHENKe-yu,WANGYan-zhi(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China;2HenanEngineering
ResearchCenterofDevelopmentofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China)1,221,2221,2
[Abstract] Objective:
ToevaluatetheeffectofSelaginellatamariscina(Beauv.)Springextract(A,B,C,D)onliverfunctionsinratswithhyperlipemiainducedbyhigh-fatdiet.Methods:
SeventymaleWistarratswerefedwithnormalorhigh-fatdietsfor4weeks.Fourweekslater,serumTCandTGwereassayed.AccordingtotheTC,hyperlipemicratswererandomlydividedinto6groups:
hyperlipidemiacontrol,positivecontroland4Sela-ginellaextract(A,B,C,D)groups(n=10ineachgroup).Ratsweresacrificedaftertreatmentfor16weeks.Weightgain,liverindex,serumALTandASTlevels,andliverTC,TG,HDL-C,LDL-C,APN,TNF-αandVLDLlevelswereassayed.Results:
After16-weekadministrationofSelaginellaextracts,ALT,AST,TC,TG,TNF-αlevelswerereducedinSelaginellaextractgroupsAandD(P<0.05and<0.01);andAPNandVLDLlevelswereincreasedinSelaginellaextractgroupsAandD(P<0.05,P<0.01)incomparisontothehyperlipi-demiacontrolgroup.TheeffectivedosewassignificantlyloweringroupDthaningroupA,whichwasonly1/4ofthedoseofgroupA.Conclusion:
Selaginellaextractsprotectstheliverinhyperlipidemicratsthroughregulating
[基金项目] 国家重大新药创制科技重大专项(2009ZX09103-440);河南省重大公益性科研招标项目(081100910800)
[作者简介] 郑晓珂,女,博士,教授,主要从事中药活性成分及其作用机制研究。
联系电话:
(0371)65575963,E-mail:
zhengxk.2006@。
2010卷第
ChineseJournalofNewDrugs2010,19(14)
liverfunctionandreducingtheaccumulationoffatintheliver.Themechanismmayrelatetoelevationofliver
VLDLlevelbytheSelaginellaextracts.ThegroupDmaybetheactivepart.
[Keywords] Selaginellatamariscina(Beauv.)Springextract;hyperlipemia;hepaticsteatosis;hepatopro-tection 高脂血症(hyperlipidemia)是脂肪肝、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的病理基础。
随着人们生活水平的提高,高脂血症的发病率呈现明显的上升趋势,成为危害人类健康的常见疾病之一。
卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏的全草,又名九死还魂草、长生不死草等。
2005年版《中华人民共和国药典》收载了卷柏和垫状卷柏(Selaginellapulvinata(HooketGrev.)Max-[1]
im.),将其列为临床规范药材。
本实验室前期对卷柏化学成分进行了全面系统的研究,从中分离出大量的黄酮类、木脂素类、核苷类和其他多酚类化合物
[2-7]
学实验动物中心);辛伐他汀(江苏黄河药业股份有限公司);丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)
试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司);脂联素(APN)试剂盒(RD公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)放免试剂盒(北京解放军总医院科技开发中心放免研究所);极低密度脂蛋白(VLDL)试剂盒(Uscnlife公司)。
主要仪器
奥林巴斯AU400全自动生化分析仪(日本O-LYMPUS光学股份有限公司);可见-紫外分光光度计(岛津U2201);KD160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);电热恒温水浴箱(北京长源实验设备厂);超低温冰箱(美国REVCO公司);电子天平、电子读数分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司产品)。
并初步研究了其药理活性。
采用去卵巢大
鼠模型研究卷柏雌激素的作用时,发现卷柏有降低大鼠血液中TC,TG,LDL-C,升高血液中HDL-C以
[8]
及降低肝脏中TC,TG水平的作用。
本实验旨在前期工作的基础上,选用饮食诱导的高脂血症大鼠模型,探讨卷柏不同提取部位对肝脏的影响。
方 法
制备高脂血症大鼠模型
70只大鼠适应性喂养3d,按体重均衡原则随机选取10只做为正常对照组,给予基础饲料喂养;其余60只给予高脂饲料喂养。
4周后,大鼠禁食12h,尾部采血,测量血液中的TC,TG含量。
根据
TC值将其随机分为模型组、阳性对照组、卷柏A,B,C和D组,每组各10只。
给药
分组后开始给药,阳性对照组、卷柏A,B,C和D组的给药剂量分别为14.5,300,85,56.84和73.74
-1
mg·kg,qd;正常对照组和模型组灌胃蒸馏水,灌胃体积为3mL,qd。
连续给药16周,每周称重1次,根据体重调整给药剂量。
卷柏各部位提取物均按临床用药的20倍换算,给药的同时继续给予高脂饲料,所有大鼠给药期间均自由进食进水。
样本的收集和测定
实验结束前1d禁食,称重,眼球取血后脱颈处死,迅速取出肝脏称重。
血液以3500r·min离心20min,分离血清。
取相同部位肝脏组织。
肝脏组织与
-1
材 料
实验动物及高脂饲料
雄性Wistar大鼠70只,体重为(210±30)g,购自郑州大学河南省动物实验中心。
大鼠被随机分为7组,分别为正常对照组、模型组、阳性对照组(辛伐他汀)、卷柏A,B,C和D组,每组各10只。
实验期间在二级动物房喂养,环境温度为(25±1)℃。
大鼠自由进食进水。
高脂饲料(配方:
78.8%基础饲料、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%猪胆盐)由郑州大学动物实验中心加工制成。
药品和主要试剂
卷柏购自本草国药堂责任有限公司。
卷柏干燥全草8.98kg,用乙醇回流提取得卷柏A(总部位),然后上聚酰胺柱用不同溶剂洗脱,得卷柏B(水部位)、卷柏C(50%乙醇部位)、卷柏D(80%乙醇部位),4个部位分别为350.1,100.8,66.34,86.06g。
猪胆盐、胆固醇(国药集团化学试剂有限公司);自制蛋黄粉(将熟鸡蛋的蛋黄晾干成粉制备而成);自制猪油(由猪肥肉提炼而成);基础饲料粉(郑州大
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血清均于-80℃冻存待用。
应用全自动生化分析仪检测血清中ALT,AST和肝脏中TC,TG,HDL-C,LDL-C的含量,放射免疫法检测肝脏中TNF-α的水平,酶联免疫法检测肝脏中APN,VLDL的水平。
体重增长和肝脏指数的测定
体重增长=给药第16周体重-造模最后1周体重。
肝脏指数/%=肝脏湿重÷给药第16周体重×100%。
5 肝脏中TC,TG,HDL-C,LDL-C水平的测定5.1 样本制备 精密称取肝脏0.1g,加入1mL0.9%生理盐水,制成匀浆液。
加入氯仿-甲醇(1∶2)3.75mL,漩涡混悬15min。
再加入氯仿1.25mL,混合1min。
离心(500r·min)10min。
弃上层液,收集下层液体,过滤杂质,真空干燥。
挥干氯仿后,加入200μL甲醇定容。
5.2 样本测定 分别用TC,TG,HDL-C,LDL-C试剂盒在奥林巴斯AU400全自动生化分析仪测定TC,TG,HDL-C,LDL-C的含量。
6 肝脏中APN水平的测定
6.1 样本制备 精密称取肝脏0.1g,加入1mL0.9%生理盐水,制成匀浆液。
20℃,3000r·min
-1
-1
8.2 样品测定 利用竞争原理,用纯化的抗体包被
微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔板中加入标准品或样品,再加入酶标抗原,标准品或样品与酶标抗原竞争性地与微孔板中的抗体结合,经过彻底洗涤后加入显色剂显色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度,通过标准曲线计算样品浓度。
数据分析
数据以x±s表示,SPSS13.0统计软件处理,各组间比较采用单因素方差分析。
P<0.05为差异有显著性意义。
结 果
大鼠一般情况观察
造模前大鼠情况良好,毛色光滑,反应灵敏;高脂饲料喂养后,大鼠出现反应不灵敏现象;给药16周后,各组大鼠活动量有所增加,反应较灵敏,其中以阳性对照组及卷柏D组改善较为明显。
给药期间共有5只大鼠死亡,解剖发现肺部水肿、充血,此为灌胃操作失误导致药物误吸入气管所致。
卷柏对大鼠体重和肝脏指数的影响模型组大鼠体重增长低于正常对照组,但无显著性差异。
阳性对照组及4个卷柏给药组体重增长均高于模型组,但与模型组和正常对照组比较均无显著性差异。
模型组大鼠肝脏指数明显升高,与正常对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
阳性对照组大鼠肝脏指数低于模型组,有显著性差异(P<0.05),4个卷柏给药组大鼠肝脏指数降低,但与模型组比较均无显著性差异。
见表1。
表1 卷柏不同部位对饮食诱导高脂血症大鼠
体重和肝脏指数的影响x±s
组 别 正常对照组模型组阳性对照组卷柏A组卷柏B组卷柏C组卷柏D组
动物数1099981010
体重增长/g189.59±57.38151.05±79.56195.50±91.26215.09±57.60197.37±78.21221.19±64.70226.66±41.67
肝脏指数/%2.48±0.293.02±0.49a2.66±0.26b2.79±0.332.71±0.192.78±0.222.79±0.13
离心15min,取上清。
6.2 样本测定 采用双抗体夹心法测定样品。
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔板中加入样品,再加入酶标抗体,使之结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加入显色剂显色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度,通过标准曲线计算样品浓度。
7 肝脏中TNF-α水平的测定7.1 样本制备 精密称取肝脏0.1g,加入1mL0.9%生理盐水,制成匀浆液。
4℃,3000r·min离心15min,取上清。
7.2 样本测定 利用液相竞争抑制原理,采用平衡法测定样品。
待测样品或标准品与限量抗原和标记抗原加在一起,进行竞争结合反应。
反应完全后,加入免疫分离剂,分离出抗原-抗体复合物,测定复合物的放射性(B),计算各标准管的结合率(B/B0)。
制作标准曲线,计算样品浓度。
8 肝脏中VLDL水平的测定
8.1 样本制备 精密称取肝脏0.1g,加入1mL
-1
0.9%生理盐水,制成匀浆液。
20℃,5000r·min离心10min,取上清。
2010卷第-1
与正常对照组比较,a:
P<0.01;与模型组比较,b:
P<0.05
3 卷柏对大鼠血清ALT和AST水平的影响
给药16周后,模型组血清ALT和AST水平均显著高于正常对照组(P<0.05)。
阳性对照组血清
ChineseJournalofNewDrugs2010,19(14)
ALT水平呈下降趋势,但与模型组比较无显著性差
异;卷柏A,D组血清ALT水平显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);B,C组血清ALT水平降低,但与模型组比较均无显著性差异。
阳性对照组血清AST水平呈下降趋势,但与模型组比较无显著性差异;卷柏A,C,D组血清AST水平显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);B组血清AST水平有所降低,但与模型组比较无显著性差异。
见表2。
表2 卷柏不同部位对饮食诱导高脂血症大鼠
血清ALT和AST水平的影响x±s
组 别 正常对照组模型组阳性对照组卷柏A组卷柏B组卷柏C组卷柏D组
动物数1099981010
-1
ALT/u·L
-1
AST/u·L
4 卷柏对大鼠肝脏TC,TG,HDL-C,LDL-C水平的影响
给药16周后,模型组肝脏中TC和TG水平均显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01);模型组肝脏中HDL-C和LDL-C水平与正常对照组比较无显著性差异。
阳性对照组肝脏中TC水平显著低于模型组(P<0.05);卷柏A,D组肝脏TC水平均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);B,C组TC水平有所降低,但与模型组比较均无显著性差异。
阳性对照组、卷柏A,D组肝脏TG水平显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);B,C组肝脏TG水平有所降低,但与模型组比较均无显著性差异。
阳性对照组、A组、D组肝脏HDL-C水平与模型组及正常对照组比较均无显著性差异;B组、C组HDL-C水平显著低于模型组及正常对照组(P<0.05)。
阳性对照组、A组、B组、C组、D组肝脏LDL-C水平均呈下降趋势,但与模型组比较均无显著性差异。
见表3。
x±s
63.83±9.1573.38±8.85a66.33±8.0564.17±8.54b69.67±5.5066.50±6.5960.17±6.05c
122.50±7.26134.13±12.41a129.13±9.34122.43±4.12b131.00±10.95124.00±11.64b
d119.00±5.54c
与正常对照组比较,a:
P<0.05;与模型组比较,b:
P<0.05,c:
P<0.01;与阳性对照组比较,d:
P<0.05
表3 卷柏不同部位对饮食诱导高脂血症大鼠肝脏TC,TG,HDL-C,LDL-C水平的影响
组 别 正常对照组模型组阳性对照组卷柏A组卷柏B组卷柏C组卷柏D组
动物数1099981010
-1
TC/mmo·Ll
-1
TG/mmo·Ll
-1
HDL-C/mmo·Ll
-1
LDL-C/mmol·L
0.30±0.060.36±0.06a0.31±0.05c0.29±0.05d0.32±0.040.33±0.040.30±0.06c
0.71±0.171.01±0.08b0.84±0.18c0.85±0.17c
e
0.99±0.93be1.00±0.85b
0.129±0.0190.128±0.0300.115±0.0290.111±0.027
c
0.101±0.018ac0.096±0.019a
0.043±0.0310.047±0.0290.044±0.0150.042±0.0260.048±0.0190.047±0.0320.039±0.020
0.82±0.18d
0.107±0.033
与正常对照组比较,a:
P<0.05,b:
P<0.01;与模型组比较,c:
P<0.05,d:
P<0.01;与阳性对照组比较,e:
P<0.05
5 卷柏对大鼠肝脏APN和TNF-α水平的影响给药16周后,模型组APN水平显著低于正常
对照组(P<0.05),模型组TNF-α水平明显高于正常对照组(P<0.01)。
阳性对照组、卷柏A,D组肝脏APN水平显著高于模型组(P<0.05,P<0.01);B,C组APN水平有升高趋势,但与模型组比较均无显著性差异。
阳性对照组、卷柏A,D组肝脏TNF-α水平均明显低于模型组(P<0.01);B组肝脏TNF-α水平明显低于模型组(P<0.01),但明显高于正常对照组(P<0.05);C组肝脏TNF-α水平较模型组有降低趋势,但无显著性差异,并且明显高于正常对照组
(P<0.01)。
见表4。
表4 卷柏不同部位对饮食诱导高脂血症大鼠
肝脏APN和TNF-α水平的影响
组 别 正常对照组模型组阳性对照组卷柏A组卷柏B组卷柏C组卷柏D组
动物数1099981010
-1
APN/μg·mg
x±s
-1
TNF-α/ng·mg
24.57±3.8919.12±2.64a24.82±3.15c29.34±9.77d21.70±2.8720.28±2.9426.95±6.51d
0.24±0.0150.29±0.033b0.25±0.011d0.25±0.022d
d0.26±0.019ae0.28±0.017b
0.25±0.008d
与正常对照组比较,a:
P<0.05,b:
P<0.01;与模型组比较,c:
P<0.05,d:
P<0.01;与阳性对照组比较,e:
P<0.01
ChineseJournalofNewDrugs2010,19(14
)
6 卷柏对大鼠肝脏VLDL水平的影响
给药16周后,模型组肝脏VLDL水平明显高于正常对照组(P<0.01)。
阳性对照组VLDL水平与模型组比较无显著性差异,但显著高于正常对照组(P<0.01);卷柏A,D组VLDL水平显著高于模型组(P<0.05,P<0.01);B,C组VLDL水平与模型组比较无显著性差异,但明显高于正常对照组(P<0.01)。
见表5。
表5 卷柏不同部位对饮食诱导高脂血症
大鼠肝脏VLDL的影响
组 别 正常对照组模型组阳性对照组卷柏A组卷柏B组卷柏C组卷柏D组
动物数1099981010
平均显著低于模型组,表明卷柏提取物可减少TC,
TG在肝脏内的积聚。
APN是一种新发现的脂肪源性物质,仅由脂肪细胞分泌硬化、降血脂等作用
[15-18]
[15-16]
具有抗动脉粥样
。
APN改善脂肪代谢的
机制可能与APN降低参与脂肪酸向肝脏转运的相
[16,19]
关转运体的表达、促进肝内脂肪酸氧化有关。
APN还可改善非酒精性脂肪肝病,其机制可能与影响肝脏脂肪代谢、周围组织对胰岛素的敏感性以及
[16,20]
炎症因子的产生有关。
炎症是脂肪肝进展为肝炎和肝硬化的主要病因,TNF-α可促进肝脏炎症、纤维化的发生和发展。
APN与TNF-α的结构十分相似,它们可与对方受体结合,而且共用1个信号通道,二者互相抑制对方的产生、互相拮抗对方的功能。
APN可能通过抑制TNF-α的表达来干预肝脏炎症与纤维化的发生、发展
[16]
x±s
-1
VLDL/μg·mg
14.50±2.9320.42±4.09a21.46±3.9625.34±2.57
aabd
。
实验结果显示,模
23.97±3.29a23.31±4.61a
ce28.82±3.14a
型组APN水平较正常对照组显著下降,TNF-α水平
较正常对照组明显升高。
卷柏提取物连续灌胃16周后,大鼠肝脏APN水平较模型组显著升高,TNF-α水平显著降低,表明卷柏提取物有升高APN和降低TNF-α水平的作用。
结合TC和TG的结果,提示卷柏有改善脂肪肝及肝脏炎症与纤维化的发生、发展的作用。
ALT,AST存在于肝细胞内。
正常情况下,由于细胞膜的包裹,肝细胞中的ALT和AST不会进入血液,但如果肝细胞受损,细胞变性、坏死,细胞膜结构和功能受到损害,肝细胞中所含的ALT和AST进入血液,血液中ALT,AST活性增加。
ALT,AST是肝细胞损伤的敏感指标,血液中ALT和AST的活性可反映肝细胞的受损程度以及肝细胞的修复情况
[21]
与正常对照组比较,a:
P<0.01;与模型组比较,b:
P<0.05,c:
P<0.01;与阳性对照组比较,d:
P<0.05,e:
P<0.01
讨 论
肝细胞是机体物质代谢最活跃的场所之一,肝脏在脂类的消化、吸收、分解、合成、及运输等代谢过程中均起重要作用,但其不具有储存脂肪的功
能。
过量的脂肪在肝脏内持久积聚可导致脂肪肝。
目前高脂血症动物模型大致分为两种:
一种是采用去势大鼠,因卵巢摘除导致雌激素分泌减少造成内源性脂代谢紊乱所引起的高脂血症模型;另一种是高脂饲料喂养导致高脂血症动物模型。
在高脂饮食诱导的脂肪肝模型中,以高脂饲料(基础饲料+1%~2%胆固醇、10%猪油或5%蛋黄粉)喂养8
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- 卷柏 提取物 改善 高脂血症 大鼠 肝脏 脂肪 保护 作用 实验 研究