教学目的使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶.docx

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教学目的使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶

课次：

10

教学目的：

使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶、启动子和终止子,掌握原核生物和真核生物的RNA聚合酶、启动子的结构特点及原核生物终止子。

重点：

原核和真核生物RNA聚合酶的组成和转录特点，启动子的结构特点及原核生物终止子。

难点：

复习旧课：

提问3人，了解教学效果。

导入新课：

第五章转录

基因表达时以DNA的一条链为模板合成RNA，这一过程就是转录（transcription）。

所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）。

转录产生初级转录物为RNA前体（RNAprecursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。

细胞中的RNA分成三种：

mRNA（信使RNA），tRNA（转运RNA）和rRNA（核糖体RNA）。

在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链（templatestrand），又叫做无意义链。

DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫做有意义链，编码链的序列与转录的RNA序列相同。

第一节转录酶和转录因子

RNA合成的基本特征：

5’→3’方向；

底物三磷酸核苷酸（NTP）

不对称转录，以单链DNA为模板。

不需要引物，合成是连续的。

一原核生物的RNA聚合酶

大肠杆菌RNA聚合酶（RNApolynerase）

需要DNA模板，Mg离子，和4种3-磷酸核苷（ATP，UTP，CTP和GTP）。

RNApol和DNApol也有2点不同：

（1）RNApol没有任何校对功能；

（2）能起始新的RNA链。

细菌RNApol由5种多肽亚基组成为α2β'βσω；分子量达50多万，可以合成3类不同的RNA（tRNA，mRNA和rRNA）。

其大小和功能如表所示：

表E.coliRNAPol的结构和功能

亚基

基因

分子量（KDa）

数目

组分

可能的功能

α

rpoA

40

2

核心酶

酶的连接，装配，决定哪些基因被转录

β

rpoB

155

1

核心酶

与转录全过程有关,和底物（核苷酸）结合

β’

rpoC

160

1

核心酶

结合DNA模板

ω

10

1

核心酶

σ

rpoD

70

1

σ因子

辨认起始点,

二真核生物的RNA聚合酶

真核生物RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶，分子量大致都在500KD左右，它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。

表2真核生物的RNA聚合酶

种类

分布

合成的RNA类型

Ⅰ

核仁

28s,18s,5.8srRNAs

Ⅱ

核质

hnRNA，SnRNA

Ⅲ

核质

tRNA，5sRNA，SnRNA

Mt

线粒体

线粒体RNAs

不同的真核聚合酶对各种抑制剂的敏感性也不同（表）

某些常用的转录抑制剂

抑制剂

靶酶

抑制作用

利福霉素

细菌的全酶

与β亚基结合，阻止起始

链霉溶菌素

细菌的核心酶

与β亚基结合，阻止延长

放线菌素D

真核RNA聚合酶Ⅰ

与DNA结合，并阻止延长

α-鹅膏蕈碱

真核RNA聚合酶Ⅱ、III

与RNA聚合酶Ⅱ结合

2.1真核RNA聚合酶的结构特点：

所有真核RNA聚合酶都是大分子蛋白质，分子量可达500KDa或更多。

它们典型的有8-14个亚基。

RNApolⅡ的大亚基有一个羧基末端功能区（carboxy-terminaldomainCTD），它含有一个多次重复的一致序列Tyr-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，这个序列是RNApol独有的。

此CTD在Ser丝氨酸或Thr苏氨酸残基上可高度磷酸化，这个酶带有非磷酸化亚基叫做RNApolⅡa，而带磷酸化亚基叫做RNApolⅡo，CTD参与转录的起始。

2.2线粒体和叶绿体的RNApol

线粒体和叶绿体转录的RNApol较小，更类似于细菌的RNApol。

第二节启动子

一原核生物的启动子

启动子（promoter）是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。

1启动子（promoter）的结构

不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同，根据其合成蛋白质的多少区别为强弱启动子。

1.1转录起始点：

多为嘌呤，CAT，A为起始点

1.2-10区

又称为Pribnow盒（原核生物）。

其保守序列为TATAAT（T80A95T45A60A50T96），其中3′端的“T”十分保守。

A.T较丰富，易于解链。

和转录起始位点I一般相距5-bp。

只有少数几个核苷酸的差别。

其功能是:

（1）RNApol紧密结合部位;

（2）形成开放启动复合体；（3）使RNApol定向转录。

1.3-35序列又称为Sextama盒（Sextamabox），其保守序列为TTGACA（T82T84G78A65C54A45），与-10序列，相隔16-19bp。

其功能是:

为RNApol的识别位点。

σ亚基才能识别并结合-35序列，为转录选择模板链。

1.4-10和-35之间距离：

1）-35和-10序列相距约16-19bp，其距离稳定，过大或过小都会降低转录活性。

2）该距离大致是双螺旋绕两圈的长度。

这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，此酶是结合在双螺旋的一面。

3）原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列之一。

RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅助蛋白质的帮助。

1.5启动子附近其他DNA序列：

⏹起始位点上游50到150bp之间的序列是启动子的完全活性所必需的。

⏹上游序列可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。

⏹远离部位序列富有AT，能增进转录起始的频率。

2原核生物不同基因的启动子的共同特点：

（1）结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；

（2）序列保守，如-35序列、-10序列结构都十分保守；

（3）位置和距离都比较恒定；

（4）对RNA聚合酶的亲和力高低影响转录频率和效率；

（5）常和操纵子相邻；

（6）都在其控制基因的5’端；

（7）决定转录的启动和方向。

二．真核生物的启动子

与原核的启动子的区别：

（1）多种元件：

TATA框，GC框，CATT框，OCT等；

（2）不同元件的组合情况：

位置、序列、距离和方向都不完全相同；

（3）需转录因子参与转录的全过程。

转录因子先和启动子结合，再与RNA聚合酶形成转录起始复合物，开始转录的过程。

2.1RNApolⅡ的启动子

通用型启动子（无组织特异性）、结构最复杂、位于转录起始点的上游、有多个短序列元件组成

（1）帽子位点（capsite）：

转录起始位点

（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

结构特点：

Ø位于－30处

Ø一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）

功能：

Ø定位转录起始点（类似原核的Pribnow框）

ØTATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的

Ø故也称为选择子（selector）

3）CAAT框（CAATbox）

结构特点：

位于－75bp处，一致序列为GGC/TCAATCT

功能：

前两个G的作用十分重要（转录效率），增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性

☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在

（4）GC框（GCbox）

位于－90附近，较常见的成分，核心序列为GGGCGG，可有多个拷贝，也可以正反两方向排列

（5）其他元件，

八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）：

一致序列为ATTTGCAT

KB元件：

一致序列为GGGACTTTCC

ATF元件：

一致序列为GTGACGT

还有一些位于起始点下游的相关元件

（6）起始子（initiator，Inr）：

位于起始点-3～+5Py2CAPy5构成，可能提供RNApolⅡ识别。

当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的作用，

无论TATA是否存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的。

2RNApolⅠ启动子

RNApolⅠ的启动子由两部分序列构成：

核心启动子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于起始位点的前后，从-45到+20，负责转录的起始。

上游控制元件（upstreamcontrolelement，UCE），从-180延伸到-107，此区可增加核心元件的转录起始的效率。

这两个区域都有一个特殊的成份，就是G.C丰富区（G.C含量达85%）。

3PolⅢ启动子的结构及起始

RNApolⅢ启动子负责tRNA,5SrRNA，某些SnRNAs的转录，这三类基因的启动子结构不同。

基因内启动子：

如5SRNA和tRNA，位于起始位点的下游的转录区内，因此也称为下游启动子（downwtreampromoter）或基因内启动子（intragenenicpromoter）或称为内部控制区（internalcontronregin,ICR）。

又分为两类：

Ⅰ型内部启动子含有两个分开的boxA和boxC序列。

而Ⅱ型内部启动子含有两个分开的boxA和boxB。

RNApolⅢ的三种类型启动子的结构如图5-2所示。

167页

基因外启动子：

如snRNA基因的启动子，包含有3个上游元件，为TATA框、次近端序列元件（proximalsequenceelement,PSE）和八聚体OCT元件。

第三节终止子

一原核生物的终止子（terminator）

终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。

两种不同的终止子：

1强终止子/内部终止子/不依赖ρ因子的结构特征：

（1）具有一个反向重复序列，由它转录出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNApol的前进；

（2）茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开；

（3）强终止子3′端上有6个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。

2依赖ρ因子的终止序列中，也没有固定的特征，不都能形成稳定的发夹；在茎中的G、C含量少，茎环易打开。

在其3′端也没有寡聚U。

ρ因子46Kda的蛋白，6聚体（275KDa）存在。

ρ因子具有依赖RNA的ATPase活性和解旋酶活性。

其功能是作为RNApol的一种辅助因子，当其浓度为RNApol浓度的10%时在体外可发挥最高的活性。

ρ因子作用机制的可能性：

[1]ρ因子与新生RNA链结合，延着RNA移动，并可能用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。

比RNApol沿DNA移动要快。

[2]ρ因子可能与RNA聚合酶结合，接触RNA-DNA杂合链、并导致其解链，而将聚合酶和RNA解离下来。

二真核生物的终止子

真核生物由于RNA转录后很快就进行了加工，因此很难确定原初转录物的3’末端。

爪蟾5sRNA的3’末端有4个U，它们前后的序列为富含G·C的序列，这是所有真核生物RNA聚合酶Ⅲ转录的终止信号。

这种序列特征高度保守，从酵母到人都很相似。

RNA聚合酶I的转录终止信号是18bp,RNA聚合酶II还不清楚是否有明确的终止元件。

归纳小结：

原核和真核生物RNA聚合酶，启动子、终止子。

布置作业：

问答题

1.σ亚基的主要作用是什么？

2.真核生物RNA聚合酶有何功能特点？

3.概括典型原核生物启动子的结构和功能。

教学后记：

课次：

11

教学目的：

使学生了解原核生物和真核生物的转录机制、原核生物转录产物的加工，掌握真核生物RNA聚合酶II的转录因子的作用特点。

重点：

真核生物RNA聚合酶II的转录因子的作用特点。

难点：

转录起始的过程

复习旧课：

提问3人，了解教学效果。

导入新课：

第四节转录的机制

⏹转录可分为三个阶段：

起始，延伸和终止。

一转录的起始

1原核生物转录的起始

1当RNA聚合酶的σ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。

2由于全酶分子较大，其另一端可在到-10区的序列，在某种作用下，整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合，在此处发生局部DNA12-17bp的解链，形成全酶和启动子的开放性复合物。

3酶移动到转录起始点，在开放性启动子复合物中转录起始位点和延长位点被相应的rNTP核苷酸前体充满，在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酸键，表示了RNA转录开始。

4在第一个核苷酸形成时σ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的σ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。

2真核生物转录的起始

2.1RNApolⅡ的转录起始

转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。

普遍转录因子，或者是基本因子TFⅡX，存在于所有启动子起始的RNA合成过程中。

它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。

表人类Ⅱ型基因的转录因子

因子

分子量

功能

RNAPolⅡ

≥10K

依赖模板合成RNA

TFⅡA

12,19,35K

稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基

TFⅡB

33K

结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F相互作用

TFⅡD

TBP,30K

TAFs

TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子

TFⅡE

34K（β）,57K（α）

结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游

TFⅡF

38,74K

大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基（rap38）和PolⅡ结合，介导其加入复合体

TFⅡH

具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸

TFⅡI

120K

识别Inr，起始TFⅡF/D结合

TFⅡJ

在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式

TFⅡS

RNA合成延伸

（1）第一步是原称为TFⅡD的转录启动因子和TATA框结合形成复物体，为RNApolⅡ指明结合位置。

（2）TFⅡA的参与使TFⅡD和TATA框结合得更稳定。

（3）TFⅡB在起始点邻近区域，从-10到+10可以部分地保护模板链，还可以使TFⅡE/ⅡF相互作用。

（4）TFⅡF的大亚基RAP74，具有ATP-依赖性DNA解旋酶活性，和起始时DNA链的熔解有关。

小亚基是RAP38，和细菌的σ因子有部分同源，紧密地和RNApolⅡ结合。

RNAPolⅡ结合位点在模板链上达到下游+15，在非模板链上达到+20，其长度贯穿了整个复合体，上游也被其保护了。

（5）TRⅡE结合在pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游双链的+30处。

（6）TRⅡH和TRⅡJ在TRⅡF之后也加入复合体中，但并不改变DNA的结合方式。

TFⅡH具有激酶活性，可以磷酸化RNApolⅡ尾巴上的CTD，CTD的磷酸化使polⅡ从转录因子中释放出来，这样就能离开启动子开始延伸。

这一起始过程和细菌RNApol催化的反应是相似的。

在没有TATA框的启动子上起始何发生呢？

这种起始同样需要一些基本的转录因子，其中也包括TFⅡD。

TFⅡD可能带有一个或多个TAFs来直接识别Inr，并与之结合。

2.2RNA聚合酶I转录起始

●核心启动子（corepromoter），负责转录的起始。

●上游控制元件（upstream,controlelementUCE），可增加核心元件的转录起始的效率。

●这两个区域都有G.C丰富区（G.C含量达85%）。

RNApolⅠ需要2种辅助因子：

UBF1（上游结合因子1）和SL1因子。

UBF1是一个单链多肽，它可以特异的和核心启动子和上游控制元件UCE的G.C丰富区结合。

UBF1和RNApol可在异源模板上发挥功能。

SL1含有4个蛋白，其中之一称TBP，TATA框结合蛋白，也是polⅡ和polⅢ起始时所需的一种蛋白质因子。

SL1在起始转录时具有种的特异性。

SL1的行为与细菌的σ因子相似，其初步功能可能是保证RNA聚合酶能位于起始位点的合适位置上。

2.3RNA聚合酶III的转录起始

表RNApolⅢ启动子的转录因子的结构和功能

因子

结构

功能

TFⅢA

38Kda,有9个锌指

结合于1型内部启动子（5sRNA基因）的C框，使ⅢC结合在C框下游，辅助ⅢB定位结合

TFⅢB

含TBP和另外二种蛋白

定位因子，使Pol结合在起始位点上

TFⅢC

含τA和τB，有5个亚基

τA结合A框，起启动子的作用；τB结合Ⅱ型内部启动子（tRNA基因）的B框，起增强子的作用。

辅助ⅢB定位结合

TⅡD

含TBP亚基

结合TATA框，确定选择PolⅢ

PBP

次近端结合蛋白

可能和ⅡD一道辅助ⅢB定位结合的另一途径

只有TFⅢB才是polⅢ所必需的起始因子。

TFⅢB的功能是作为一个“定位因子”（positioningfactor），负责RNApol结合正确位置上。

TFⅢA和TFⅢC仅是一种装配因子（assemblyfactor），它们的作用是辅助TFⅢB结合到正确的位置上。

TFⅢB在启动子上结合在pol的前方，本身并不能和DNA结合。

需要依靠ⅢA、ⅢC协助，形成一种前起始复合体结合在特异位点上，然后再直接和pol结合。

总之，无论哪一种启动子，TBP都是起始复合物的组成部分，与RNApol的相互作用中发挥共同的作用。

通过不同机制是聚合酶结合在各种类型的启动子上。

二转录的延伸

第一个碱基加上后延伸开始，聚合酶不断前移，起始因子脱离聚合酶，而一些延伸因子与聚合酶复合物结合。

整个转录过程中产生的RNA分子与DNA模板形成大约12bp长的RNA-DNA杂交区。

在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。

转录速度大约是每秒钟30-50个核苷酸。

三转录的终止（Termination）

原核生物的终止子

强终止子，也称为内部终止子。

弱终止子，又称为ρ依赖性终止子。

◆抗终止作用：

ρ因子的作用被抵消，使得RNA聚合酶通过终止子继续转录后面的基因。

抗终止作用不是更替启动子，而是转录的继续延伸。

λ噬菌体基因表达存在抗终止作用。

真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly（A），因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚。

第五节转录产物的后加工

一原核生物转录产物的后加工

转录后的加工（posttranscriptionalmodification）是指将各种前体RNA分子加工成成熟的各种RNA。

顺反子：

与多肽链相对应的DNA片段连同启动部位和终止部位。

一次转录下来的mRNA可以含有一个顺反子或是有多个顺反子。

原核生物mRNA的寿命比tRNA、rRNA的短，象细菌的mRNA半衰期只有几分钟。

mRNA很容易从5’-P降解，有些生物的mRNA5’-P端被修饰，保护，而不易降解。

tRNA和rRNA都不是最初的转录产物，这是由于：

（1）它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；

（2）分子比初始转录物小；

（3）tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。

1rRNA的加工

大肠杆菌的rRNA有三种：

16S，23S和5S。

原核生物rRNA转录后加工，包括：

①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ，RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基。

2tRNA的加工

1）剪切、修剪和剪接：

剪切：

E.coli中的RNA酶P，是一种tRNA内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5'端。

RNA酶P由蛋白质和RNA二者组成，分子中RNA有375个碱基长（约130KD）；而蛋白质组分要小得多，大约只有20KD。

RNA和蛋白质这两个组分对RNA酶P的催化活性似乎都是必须的。

RNA酶D，为外切酶，能从RNA的3'端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3'端。

RNA酶Ⅱ，外切核酸酶，它能够将tRNA完全分解完。

RNA酶F是内切酶，作用在3‘端，

作用于rRNA的RNA酶III和RNA酶E对tRNA的加工也有一定的作用，但不是必须的。

拼接：

经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。

2）核苷修饰

tRNA甲基转移酶是一种修饰酶，催化嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA，使得tRNA分子中出现稀有碱基。

3）3’末端加上CCA：

在核苷酸转移酶作用下，3’--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端。

在细菌中有两种tRNA前体：

Ⅰ型分子有CCA三联体在其3‘端，作3′修复的信号和最后的界线。

Ⅱ型分子没有CCA序列如某些噬菌体编码的，需要后加上CCA。

3原核前体mRNA的加工

原核生物的mRNA很少经过加工，由于转录和翻译偶联，一般情况下一边转录一边就进行翻译，中间没有可加工的间歇时间。

但在少数情况下多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。

归纳小结：

原核和真核生物RNA转录起始、延伸和终止，原核生物转录产物tRNA和rRNA的加工。

布置作业：

问答题：

1.阐述原核生物的转录终止。

2.真核生物RNA聚合酶II的转录起始过程如何？

3.列举原核生物和真核生物转录的差异。

4.哪些转录因子含有TBP？

为什么它们被称为定位因子？

教学后记：

课次：

12

教学目的：

使学生了解真核生物转录后加工、掌握真核生物mRNA加工和内含子的剪接。

重点：

真核生物mRNA加工和内含子的剪接。

难点：

内含子的剪接机制

复习旧课：

提问3人，了解教学效果。

导入新课：

二真核生物的转录后加工

1rRNA转录后加工

真核生物的18S，5.8S和28SrRNA基因是串联在一起形成一个转录本，初始转录本为45S前体，5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。

从中间产物的大小来看rRNA前体的加工可能有多种途径。

Hela（人类）细胞和L（鼠）细胞中rRNA的加工途径：

2tRNA转录后的加工修饰

真核tRNA的基因和原核不同：

（1）真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区;

（2）真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多;；

（3）5′端全有单磷酸核苷酸，表明已被加工过；

（4）tRNA的前体分子中含有内含子。

真核tRNA的加工和原核相似，刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接；②甲基修饰；③3’-OH连接-ACC结构。

但也有区别：

增加了剪接内含子的过程；都要加CCA。

3真核mRNA的加工和成熟

1）．在5’端加帽

5’端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。

O型为m7GpppN；

I型为m7-GpppN1mp，即转录出的mRNA的第一位碱基也被甲基化（C2甲基化）；

II型为m7GpppN1mpN2mp，即mRNA的第一个碱