苗口服接种新载体荆豆凝集素化壳聚糖纳米粒传输系统的研究doc.docx
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苗口服接种新载体荆豆凝集素化壳聚糖纳米粒传输系统的研究doc
苗口服接种新载体:
荆豆凝集素化壳聚糖纳米粒传输系统的研究
李凤前,费轶博,刘继勇,朱全刚,胡晋红
第二军医大学长海医院药学部,上海200433
摘要
本文依据肠黏膜及派伊尔集合淋巴结(peyer’spatches,PP)的免疫学特点,以乙型肝炎疫苗为模型药物,将能同肠道微皱褶细胞上岩藻糖特异性结合的荆豆凝集素,对壳聚糖进行修饰,构建并研究PP定位的疫苗微粒口服传输系统。
离子交联-高压匀化工艺制备的壳聚糖纳米粒形态较规则。
用激光散射粒度仪测定纳米粒平均粒径为366.8nm,多分散系数为0.122,粒度分布较窄。
以低温高速离心法测得乙肝疫苗纳米粒平均包封率在90%以上,通过SDS-PAGE电泳表明,乙肝疫苗在反应前后没有发生分子量的变化。
用戊二醛活化法制备凝集素修饰的壳聚糖纳米粒,结合率可达85.3±3.2%。
岩藻糖的存在会让BSM与凝集素化纳米粒的结合受到抑制,凝集素在结合到纳米粒表面后糖结合活性的保持。
荧光显微镜观察发现纳米粒在淋巴结中有一定富集效果。
与市售制剂肌注组、口服乙肝疫苗未凝集素化纳米粒组、口服乙肝疫苗组、阴性对照组(生理盐水)比较,口服凝集素化乙肝疫苗纳米粒组在Balb/c小鼠,能在一定程度上引发免疫应答。
本研究表明,凝集素化壳聚糖纳米粒可以作为疫苗类药物有效的载体,用于肠PP的定向给药,为疫苗口服免疫开辟了新思路。
关键词:
离子交联-高压匀化法;多聚磷酸钠;凝集素化壳聚糖纳米粒;岩藻糖;牛颌下腺粘蛋白;疫苗口服接种;派伊尔集合淋巴结
Newparticularcarrieroforalvaccination:
UlexeuropaeusagglutininAnchoredchitosannanoparticlesdeliverysystem
Feng-QianLi,Yi-BoFei,Ji-YongLiu,Quan-GangZhu,Jin-HongHu
DepartmentofPharmaceuticalSciences,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai,200433,China
Abstract
Thispaperisproposedupontheimmunologiccharacteristicsofenteric-mucosaandPeyer'spatches(PP).Biodegradablematerialofchitosanwasmodifiedwiththelectinofulexeuropaeusagglutinin(UEA),whichcouldbespecifictotherhodeosewithinthemicrofoldcellunderintestinaltract,andthenusedfornanoencapsulation.ThemodelhepatitisBvaccinewasthenentrappedwithinthelectinanchorednanoparticlesfororaldelivery.
Theuniform-shapedchitosannanoparticleswerepreparedbyinonotropicgelation-homogenizationprocesswithtripolyphosphateasgelatinizer.Themeandiameterofthechitosannanoparticleswas366.8nmwiththepolydispersityindexof0.122.Thevaccineentrapmentefficiencyofnanoparticleswhichisseparatedbycentrifugalizationwasabove90%.Thelectinanchoredchitosannanoparticleswerepreparedwiththeglutaraldehydeactivationmethod.Andthebindingrateof85.3±3.2%couldbeachieved.TheinteractionsbetweenlectinanchorednanoparticlesandBovinesubmaxillaryglandmucindecreasedstronglywhenthecompetingsugarofα-(L)-fucoseadded.Theseresultsclearlysuggestedthattheremainedactivityoflectinanditsspecificbindingcharacteristicstofucose.Resultoffluorescencemicroscopestudyshowedthatthelectinanchorednanoparticlescouldbeenrichedinthepayer’spatch.TheHBsAgantibodyconcentrationsofbloodserumsamplesofmiceindifferenttimeweredetectedafterintragastricadministrationofHBsAg,plainHBsAgnanoparticles,lectinanchoredHBsAgnanoparticlesandphysiologicalsalinegroup.Theresultsalsoshowedthatthelectinanchorednanoparticlesweremoreefficientthanothergroupsexcepttheintramuscularinjectionofclinicaldosageform
Theaboveresultsshowedthatlectinanchoredchitosannanoparticleswouldbeapromisingcarrierforpeyer’spatchlocateddrugdelivery,andmightreferrednovelconsiderationforthedevelopmentoforaldeliveredvaccinedosageforms.
KeyWords:
Inonotropicgelation-homogenizationprocess;Tripolyphosphate;Lectinanchoredchitosannanoparticles;Fucose;Bovinesubmaxillaryglandmucin;Oralvaccination;Peyer'spatches
疫苗在流行病防治方面发挥重要作用,口服接种疫苗对于重大流行性疾病、突发紧急疫情的防控意义重大,口服疫苗给药系统(orallyadministeredvaccinedeliverysystem,OAVDS)能方便且直接刺激易感染部位产生抗体,在减少接种次数、降低接种脱漏率、提高疫苗贮运管理效率及简化接种方式等方面具有重要意义。
因此,以胃肠道黏膜为输送部位的OAVDS,是目前疫苗给药系统研究最活跃的领域之一。
肠系淋巴组织中富含的派伊尔集合淋巴结(peyer’spatches,PP)对抗原的摄取具有特异性[2],PP参与免疫调节作用,是疫苗口服吸收和免疫抗体反应的重要部位。
但口服疫苗将直接受到胃肠道中pH环境及各种酶系的影响,在抗原经M-细胞到达集合淋巴小结PP的途中易被降解,其吸收效率也低,在目标作用部位的抗原不足,到达PP附近的疫苗一般难以引发有效的免疫应答反应。
因此,OAVDS的设计需充分考虑胃肠道吸收和转运的‘形态学屏障’(上皮细胞、黏膜)和‘生理学屏障’(胃肠酶系、pH、传递体)[1,2]。
微囊化(Microencapsulation)技术在保护疫苗和促进吸收方面能起到较好的协同作用,微粒系统可“克服”胃肠道屏障,由胃肠道M-细胞以跨膜转运或细胞旁路的方式摄入。
在微粒表面结合能识别M-细胞的特异性基团或受体,可使疫苗的递送具有一定的靶向性,有利于高效疫苗传输系统的定位设计。
荆豆等外源性凝集素可特异性地识别M-细胞膜表面上糖蛋白中富含的岩藻糖,并与之结合[3,4],这为口服疫苗定位滞留释放系统的研究提供了设计思路。
考虑到天然高分子材料壳聚糖所带正电荷对肠上皮紧密结合点的开放机制[5],能促进肠道上皮细胞对大分子物质的吸收[6],且壳聚糖具有对蛋白有利的结合位点。
本文以其为载体材料,应用离子交联-高压匀化工艺制备壳聚糖纳米粒,采用微量戊二醛法对壳聚糖纳米粒进行凝集素化修饰,验证了荆豆凝集素化纳米粒的糖结合特异性,进一步考察了凝集素化纳米粒在PP中的定位情况及其在小鼠体内抗体滴度变化情况。
该研究工作,可对凝集素化微载体作为疫苗经口服胃肠道接种的可行性提供实验依据和技术借鉴。
1仪器、材料、试剂及动物
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂制造);EMS-2型加热定时磁力搅拌器(天津欧诺仪器仪表有限公司);高压均质机AH110D(ATSENGINEERINGNCORPORATED);全自动酶标分析仪ELX-800(美国Bio-Tek公司);ZLS型电位/粒度激光散射测定仪(Barbara,USA);台式高速冷冻离心机(SuperT21,SORVALL,USA);透射电子显微镜(HITACHIH-600,日本日立公司)。
10A岛津HPLC系统;凝胶色谱柱(TOSHO;TSK-GELG2000SWXL7.8300mm)。
乙肝疫苗(北京天坛生物制品公司,分子量24KDa);壳聚糖(上海如吉生物科技发展有限公司,脱乙酰度90%,平均分子为40-80kDa);三聚磷酸钠(国药集团化学试剂有限公司,化学纯);冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)分析纯;MicroBCA试剂盒(美国Pierce公司);荆豆凝集素,BSM,岩藻糖(Sigma)。
8周鹷BALB/C小鼠(20±2g),由本校动物实验中心供应,合格证号:
SCXK沪2003-0006。
2方法
2.1“离子交联-匀化法”制备壳聚糖纳米粒[7]
将CS溶于稀醋酸水溶液中(隔夜溶胀),配成0.2%(w/v)的壳聚糖溶液,TPP溶于蒸馏水配成0.2%(w/v)的溶液。
在不断搅拌下(磁力搅拌,600rpm),将TPP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中(滴速约为3ml/min),由澄明溶液逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系,根据乳光强弱可判断纳米粒的形成。
将离子交联制得的壳聚糖胶体溶液体系进一步经高压匀化技术处理。
调节乳匀机的压力,一级阀压力600bar,二级阀压力60bar,将用离子交联法制备的胶体液置入高压乳匀机中,乳匀后收集样品,再置入乳匀机,反复四次,收集样品,得到纳米粒。
2.2壳聚糖纳米粒的外观形态及粒径[8]
取纳米粒胶体混悬液1~2滴置于铜网上,用2%的磷钨酸进行负染,以透射电子显微镜观察纳米粒的形态并拍照。
取少量的CS-NPs混悬液,用蒸馏水稀释3倍,用激光粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径。
测定条件:
光源:
He-Ne激光(0=632.8);介质:
水;电场强度:
E=10v/cm;粒径散射角:
90。
,每组重复实验三次。
2.3荆豆凝集素对壳聚糖纳米粒的结合及修饰
将以“离子交联法-匀化工艺”制备的壳聚糖纳米粒混悬液进行离心,离心条件:
20000rpm、30min。
弃去上清液,下层纳米粒用PBS洗涤3次,洗去未参与交联反应形成纳米粒的壳聚糖。
然后向分离得到的下层纳米粒中,加入少量PBS溶液,漩涡使之均匀分散。
加入适量戊二醛液(25%,w/v),将混合样品置于恒温水浴摇床上振摇6小时(温度:
25℃,80振次/分钟)。
振摇活化的壳聚糖上活性伯胺基,以PBS洗涤3次,以除去未反应的戊二醛溶液,将离心后的沉淀物分散于PBS溶液中,备用。
向经戊二醛活化的壳聚糖纳米粒中加入荆豆凝集素溶液,常温放置过夜。
离心分离上清液。
采用所建立的蛋白凝胶色谱分析法测定凝集素的含量,根据测得的游离凝集素量和加入总量的差值,计算凝集素在壳聚糖纳米粒上的结合率,进一步考察胺基活化剂戊二醛对凝集素结合率的影响。
2.4凝集素化纳米粒与牛颌下腺粘蛋白(Bovinesubmaxillaryglandmucin,BSM)的结合试验
BSM是凝集素特异性结合受体,但当凝集素活性发生改变时,BSM即不能与凝集素有效结合,利用该性质可以检验凝集素活性。
将凝集素化壳聚糖纳米粒混悬液同BSM的PBS液混合,漩涡混悬5Sec,室温孵育3h,后离心(5000rpm,15min)分离未结合的BSM,测定上清液中的BSM量,根据测定值和加入总量的差值,计算凝集素化壳聚糖纳米粒对BSM的结合率。
2.5岩藻糖对凝集素化纳米粒同BSM结合的竞争抑制作用
岩藻糖是活性凝集素特异性结合受体,可以竞争BSM与凝集素化纳米粒的结合作用,降低BSM对凝集素化纳米粒的结合。
如果凝集素的活性丧失,则不能体现出竞争抑制结合现象,由此将进一步考察凝集素化纳米粒上荆豆凝集素的活性。
同上法,在纳米粒和BSM的结合过程中加入岩藻糖,测定结合率变化情况。
2.6疫苗的包载及包封率
采用“两步法”,将制备好的凝集素化壳聚糖纳米粒和乙肝疫苗溶液混合,温孵2h。
然后取1ml乙肝疫苗纳米粒,置入离心机中离心(20000rpm,30min,10℃),取上清液,用凝胶色谱柱测定上清液中乙肝疫苗含量,按下式计算壳聚糖纳米粒的包封率和载药量。
包封率(%)=
×100%;载药量(g/mL)=
2.7凝集素化纳米粒在肠PP中的定位
将荧光素加入凝集素化纳米粒,壳聚糖纳米粒中,于37℃孵育3h,取出,制备荧光素化纳米粒。
Balb/c小鼠禁食一天,清理肠胃。
口服凝集素化纳米粒,三小时后解剖后立即分离小肠,用37℃抗生素液洗涤。
每只动物取出6段(每段3cm)小肠,前3段从空肠(无派伊尔淋巴结)取得,后3段从回肠(有派伊尔淋巴结)取得,用37℃生理盐水灌洗三次。
保存于甲醛溶液中,冷冻切片,用荧光显微镜观察切片,比较凝集素化纳米粒和非凝集素化纳米粒对于派伊尔淋巴结靶向性的比较。
2.8疫苗纳米粒经小鼠灌服后的血清抗体滴度
25只Balb/c小鼠随机分为五组,A:
肌内注射组(市售乙肝疫苗试剂),B:
口服凝集素化乙肝疫苗纳米粒组(自制制剂),C:
口服未凝集素化乙肝疫苗纳米粒组,D:
口服乙肝疫苗,E:
口服生理盐水(阴性对照组)。
给药前2小时,小鼠禁食,灌胃100l7.5%的碳酸氢钠溶液以中和胃酸。
每组小鼠按照组别分别给药。
A:
小鼠肱肌注射0.1ml市售乙肝疫苗制剂(10g/ml);
B组:
组灌胃0.5ml凝集素化纳米粒制剂,包载乙肝疫苗0.1ml(100g/ml);
C组:
灌胃0.5ml未凝集素化纳米粒制剂,包载乙肝疫苗含量0.1ml(100g/ml);
D组:
灌胃乙肝疫苗(20g/ml)0.5ml;
E组:
灌胃生理盐水0.5ml。
给药两周后,眼眦静脉丛取血,每只小鼠取出400l左右血液,离心(10000rpm,30min),分离上清,冻于-70℃,待测。
同时按照前次分组进行加强免疫,分别于4、6、8、12、24周眼眦静脉取血,分离血清,冻于-70℃,待测,实验结束时用乙肝表面抗体检测试剂盒测定。
3结果与讨论
3.1壳聚糖纳米粒及相关性质
壳聚糖是自然界来源第二大丰富的亲水性多糖,具有生物粘附性和生物相容性,广泛作为药用辅料。
1989年,Bodmeier等首次报道了离子交联法用于制备壳聚糖纳米粒的制备,利用壳聚糖的游离氨基与TPP阴离子发生分子间或分子内交联反应,从而制备壳聚糖珠球状凝胶。
由于该实验反应条件温和,易于调控反应结果,不使用有机溶剂,特别适于多肽、蛋白质等一类大分子药物的包载。
离子交联法是利用CS的正电性与TPP的负电性产生的静电引力作用而形成分子内或分子间交联反应,从而自发形成纳米级微粒。
Fig.1TEMphotographsofchitosannamoparticlesbyinonotropicgelation(left)andbyinonotropicgelation-homogenizationprocess(right).
图1A为离子交联法制备的CS-NPs的透射电镜照片,可见,纳米粒形态不规则,部分呈网状结构。
图1B为经过高压匀化的壳聚糖纳米粒图片,可见,经过匀化后,纳米粒外观规则较圆整,大小较均匀。
图1-4为没经匀化的纳米粒的粒径分布图,纳米粒粒径分布较宽,图2为经过匀化前后纳米粒粒径分布图,可以看出纳米粒粒径分布明显变窄。
Fig.2Thesizedistributionsofcross-linkedchitosannanoparticlesbefore(left)andafterhomogenization(right).
离子交联法是利用荷正电的CS与荷负电的TPP分子之间的静电引力作用而形成的,但是由图2可以看出,形成的纳米粒的粒径多分散系数较大,即纳米粒粒径较不均匀,长时间放置就会形成沉降现象,影响纳米粒制剂的稳定性。
微粒体系中,微粒粒径均匀度是体系是否稳定的一个重要评价指标,粒径不均匀,粒子容易沉降,稳定性差。
高压乳匀是在近室温条件下,通过调节高压乳匀机的压力,使高压产生的强大推动力使纳米粒通过乳匀机的细孔,从而匀化纳米粒的粒径。
乳匀前后,纳米粒粒径的多分散系数由0.4左右降低到0.1左右,这可以说明,通过高压乳匀,纳米粒的粒径变得更加均匀,从而提高纳米粒的稳定性。
3.2戊二醛加入量对凝集素与壳聚糖纳米粒结合率的影响
凝集素与微载体表面官能团发生共价结合,结合主要分为活化和连接两个过程。
活化过程是修饰的关键,主要将微载体表面的官能团转化为能够与凝集素表面氨基结合的基团,或者将特殊基团引入凝集素分子,通过该基团与微载体官能团特异结合,而将凝集素结合到微载体,主要有碳化二亚胺法[9]、戊二醛法[10]、硫醇化法[11]等。
而碳化二亚胺法主要针对于表面存在羧基的微粒。
硫醇化法在存在有顺丁烯二酰亚胺的PEG时才可发生。
本文应用的载体材料壳聚糖,表面存在大量的游离氨基,故选择戊二醛活化法来实现荆豆凝集素对壳聚糖纳米粒的修饰。
Fig.3ChemicalreactionsinvolvedduringtheactivationofCSwithglutaraldehydeandboundofUEAontotheactivatedCS.
如图3所示,戊二醛首先聚合成为多醛,多醛与壳聚糖表面的游离氨基通过氨醛缩合反应结合,从而将醛基引入壳聚糖表面,至此称之为活化过程。
接着,凝集素表面的氨基与携带醛基的壳聚糖分子发生氨醛缩合,从而将凝集素连接到壳聚糖分子[10]。
Fig.4Effectofincreasingconcentrationinthebindingofulexeuropaeuslectintochitosannanoparticles.Experimentalconditions:
roomtemperature,reactiontime6h,PBS(pH7.4),n=3.
由图4可见,随着戊二醛加入量的增加,凝集素与壳聚糖纳米粒的结合率逐渐增加,当戊二醛加入量为200μl时,结合率达到最大(80%),当戊二醛的加入量增加到500μl时,结合率反而下降。
这可能由于增加活化剂戊二醛的量时,引入壳聚糖表面的醛基增加,则相应的与凝集素结合率就增加,然而,壳聚糖分子表面的结合位点也是有限的,当加入过多量的戊二醛时,并不能使醛基都结合到壳聚糖分子的表面,同时由于壳聚糖分子表面的醛基与凝集素的氨基的结合也存在一定饱和性的,所以呈现这样的结合趋势。
3.3凝集素化纳米粒与牛颌下腺粘蛋白(Bovinesubmaxillaryglandmucin,BSM)的结合试验
BSM是凝集素特异性结合受体,但当凝集素活性发生改变时,BSM即不能与凝集素有效结合,利用该性质可以检验凝集素活性。
Fig.5KineticsofBSMinteractionwithulexeuropaeuslectinanchoredchitosannanoparticles(UE-CS-NP)andchitosannanoparticles(CS-NP)usedascontrols.Experimentalconditions:
roomtemperature,PBS(pH7.4),n=3.
图5显示:
BSM可以同壳聚糖纳米粒结合,随着BSM用量的增加,结合率反而下降,说明BSM同壳聚糖结合具有饱和现象。
凝集素化壳聚糖纳米粒同BSM的结合率,明显高于未凝集素化的壳聚糖纳米粒,体现了荆豆凝集素的活性。
当BSM的加入量为200l时,BSM同凝集素化纳米粒的结合率与空白纳米粒的结合率间差值最大。
3.4岩藻糖对凝集素化纳米粒同BSM结合的竞争抑制作用
岩藻糖是活性凝集素特异性结合受体,可以竞争BSM与凝集素化纳米粒的结合作用,降低BSM对凝集素化纳米粒的结合。
如果凝集素的活性丧失,则不能体现出竞争抑制结合现象,由此将进一步考察凝集素化纳米粒上荆豆凝集素的活性。
Fig.6BSMbindingtoUE-CS-NPandCS-NPinsuspensionswithout(A)orwith(B)100mmolfucose.Experimentalconditions:
roomtemperature,incubationtime1h,PBS(pH7.4),n=3.
图6为岩藻糖加入前后,BSM结合率的变化情况。
可以看出:
荆豆凝集素化壳聚糖同BSM的结合率显著下降,由87%降至74%。
而未凝集素化的壳聚糖纳米粒同BSM的结合率几乎未变化,维持在70%左右。
表明荆豆凝集素同BSM的结合作用,可以被岩藻糖竞争抑制,反应出凝集素化壳聚糖纳米粒上锚合的凝集素活性保持。
岩藻糖是除BSM外的另一特异性结合受体。
将一定量的岩藻糖加入BSM溶液中,岩藻糖与凝集素的特异性结合必定抑制BSM与凝集素化纳米粒的结合,所以加入岩藻糖的BSM溶液与凝集素化纳米粒的结合率比BSM溶液凝集素化纳米粒结合率低,从而验证了凝集素在连接到壳聚糖纳米粒表面后活性的保持情况。
3.5、乙肝疫苗的包载及其在纳米粒中的包封率和载药量测定
包封率和载药量是评价纳米粒制剂质量和制备工艺的重要指标,因此本研究进行了包封率和载药量测定方法的考察。
测定纳米粒包封率及载药量的方法主要有超滤法、层析-离心法(即粗品经SephadexG-50葡聚糖凝胶柱纯化后超高速离心,破坏纳米粒释放其中包裹的药物)及
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