分子生物学实验指导书剖析.docx
- 文档编号:10219752
- 上传时间:2023-02-09
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:31.82KB
分子生物学实验指导书剖析.docx
《分子生物学实验指导书剖析.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学实验指导书剖析.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分子生物学实验指导书剖析
实验指导书
院系:
生态与资源工程系
专业:
生物工程
课程:
分子生物学
编者:
生物工程教研室
目录
实验一植物总DNA的提取3
实验二DNA琼脂糖凝电泳定量及质量检测6
实验三PCR扩增获取目的基因9
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化10
实验一植物总DNA的提取
一、实验目的:
通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法,并为后续的实验准备DNA样品。
二、实验原理与方法:
2.1DNA提取的原理
植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。
植物细胞具有坚硬的细胞壁,液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。
而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。
常用的去污剂有SDS(sodiumdodecylsulfate,十二烷基硫酸钠),CTAB(cetyltrimlthylammoniumbromide,十六烷基三乙基溴化铵)等。
细胞壁、细胞膜及核膜破坏后,释放出细胞内含物至提取缓冲液,内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。
将其他组分除去或降解,然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。
磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部,取上清液、弃残渣,上清中加入苯酚和氯仿(三氯甲烷)处理后经离心蛋白质沉淀于有机相(下相)和水相(上相)的界面处。
水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonucleaseA,RNaseA)则使RNA降解,而DNA仍完整。
加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出,絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获,并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。
2.2DNA提取的质量要求
对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性(即没有或很少降解)和样品的高纯度(即蛋白质和RNA等的污染程度低)。
但对DNA样品的质量要求程度的高低依DNA样品用途而定。
2.2.1导致DNA降解的因素及对策
①物理因素:
机械剪切力和高温。
对策:
DNA样品制备时要求动作轻缓;避免溶液的过多转移,特别是用小口径吸管的过多转移;避免高温。
②细胞内源DNA酶:
细胞内含活性很高的DNA酶,细胞破碎后便可与DNA接触并使其降解。
对策:
为避免或纯化DNA酶活性,在DNA提取液中常选择加入EDTA、SDS、CTAB及蛋白酶等。
EDTA能整合Ca2+、Mg2+,而Ca2+、Mg2+是DNA酶的辅因子。
SDS和CTAB能使蛋白质变性(DNA酶也是蛋白质),蛋白酶可降解蛋白质。
③化学因素:
在过酸的溶液条件下,DNA分子可脱嘌呤,DNA分子极易在碱基脱落处断裂降解。
对策:
避免DNA按触过酸溶液。
2.2.2.造成DNA污染的主要因素及对策
①蛋白质:
体内DNA常与蛋白质结合,蛋白质的污染会影响到后续的DNA操作。
对策:
苯酚、氯仿抽提可使蛋白质变性而DNA不受影响。
②RNA:
污染后果依DNA的用途而异。
对有些DNA实验,RNA的污染可能无关大局,而对有些实验则至关重要。
对策:
RNA本身极易降解,如有必要去除则可用无DNA酶活性的RNaseA(DNase-freeRNaseA)处理。
三、实验条件:
1.材料
(1)取植物嫩叶,去其叶梗及大的叶脉,用清水清洗干净,去掉表面污物,然后自然晾干或用纱布、卫生纸吸干表面残留的水分,切莫让叶片组织失水萎焉,迅速用于实验。
如不能及时用于实验,可将其切碎、称重、标记,盛于干净的塑料袋内,置低于-20℃冰箱中冰冻保存,待用。
(2)吸头1000μL110
(3)吸头200μL110
(3)吸头20μL1000
(4)吸水纸5卷
(5)一次性手套50双
(6)口罩110个
2.仪器
(1)离心机
(2)水浴锅
(3)冰箱与冰柜
(4)小三角瓶
(5)研钵
(6)振荡器
(7)微量移液器
3.试剂
(1)研磨缓冲液:
每升含氯化钠26.2989,柠檬酸三钠13.2509,EDTA37·2305,pH7.0;10mL
(2)SDS溶液;0.1g
(3)氯仿-异戊醇混合液(24:
1,v/v);20mL
(4)5mol/LNaCl;2.5mL
(5)95%乙醇;50mL
(6)10×SSC溶液:
87.70g/LNaCl,44.10g/L柠檬酸三钠,pH7.0;
(7)0.l×SSC溶液:
10×SSC溶液稀释100倍。
四、实验步骤:
1、称取10g植物材料,加入等量(w/v,g/ml)研磨缓冲液,再加入1%十二烷基硫酸钠(SDS),少量石英砂,研钵中研磨10min;
2、研磨浆状物加入等体积(V/v)的氯仿-异戊醇混合液(24:
1,v/v)于三角瓶中,加盖,轻摇1-3min,以脱除组织蛋白质。
注意摇勿过剧,以防DNA变性;
3、混合物室温下离心(3800-4000r/min)5min,使混合物分层。
小心吸取上层含核酸的水相,弃去中层残渣、蛋白和下层氯仿;
4、收集的水溶液倒入在72℃水浴中预热的容器中,并在72℃中继续保温4min(不超过4min),以灭活溶液中DNA酶。
然后取出容器,冷水中冷却到室温以下;
5、在该溶液中加入1/4量(v/v)的5mol/LNaCl(或NaClO4·H2O)溶液,使溶液中钠盐浓度为1M。
再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:
1,v/v),轻摇3min,再次脱除核蛋白;
6、振荡后的混合液再次离心(3800-4000r/min)5min,使混合物分层。
小心吸取上层含核酸的水溶液,弃去中层变性蛋白和下层氛仿;
7、加入二倍于核酸水溶液的95%预冷(3℃以下)乙醇,玻棒轻轻搅动,核酸以纤维状析出,缠绕在玻棒上。
此时核酸呈透明、胶状、吸水性极大;
8、将玻棒上的核酸在容器壁上轻压沥去水分,浇洗少量乙醇,再次沥干。
然后将此核酸溶解在适量的0.l×SSC溶液(10×SSC溶液稀释100倍。
10×SSC溶液为87.70g/LNaCl,44.10g/L柠檬酸三钠配制的pH7.0水溶液)中,加入1/10体积的10×SSC溶液,使其成为l×SSC溶液,备用。
五、实验注意事项:
1、选取新鲜材料,研磨迅速彻底,研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀;
2、若提取产物有颜色,可能是材料中含有较多的多酚类物质,添加巯基乙醇(2-5%),尽可能选取幼嫩的材料;
3、脱组织蛋白时,摇晃不宜过剧,过剧振荡易引起核酸变性,因而影响DNA收率和活性;
4、为了获得具有生物活性的天然核酸,在分离制备过程中必须采用温和的条件,避免过酸过碱、剧烈地搅拌,防止热变性,同时还要避免核酸降解酶类的降解。
实验二DNA琼脂糖凝电泳定量及质量检测
一、实验目的
1、了解:
琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理;
2、掌握:
琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法;
3、熟悉:
琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作过程。
二、实验原理与方法:
琼脂糖凝胶电泳是检测DNA的常用方法。
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取,是一种聚合链线性分子,实验室中常用两种琼脂糖,即常熔点的和低熔点的,它们都是琼脂的衍生物,具有很高的聚合强度和很低的电内渗,都是良好的电泳支持介质。
核酸分子是两性解离分子,在pH3.5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个核酸分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在pH值为8.0~8.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。
不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
由于DNA分子的电荷密度大致相同,即相同数量的链DNA几乎具有等量净电荷,它们以同样速度向正极移动,因此,在一定电场强度下,DNA分子的移动速率取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样,可进行分离。
其迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对质量相同,但构型不同的DNA分子。
如抽提质粒DNA过程中,由于各种因素的影响,使提取的质粒可能存在三种构型:
①超螺旋的共价闭环状质粒(CC);②解旋开环质粒DNA(OC);③线状质粒DNA(L)。
电泳中,泳动最快的是CC,其次为L,最慢的为OC。
DNA在琼脂糖中的电泳迁移速率主要取决于:
样品DNA分子大小、DNA分子构象、琼脂糖浓度、电场电压、缓冲液、温度等。
加入EB,并将已知浓度的标准样品和已知分子量大小的标准DNA片断(即marker)作琼脂糖凝胶电泳对照,可分别检测样品的浓度和分子量大小。
三、实验条件:
1.实验材料
(1)实验一所制备的DNA样品
(2)一次性薄膜手套
2.实验仪器
(1)微波炉
(2)琼脂糖凝胶电泳系统
(3)紫外线投射仪
(4)电泳仪
(5)水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块
(6)250mL三角瓶
(7)微量移液取样器
(8)0.5mL离心管
(9)双面微量离心管架
(10)试管架
3.实验试剂
(1)已知浓度的λDNA标样。
市场购得的λDNA标样稀释至0.2μg/μL或0.1μg/μL,应用时甚为方便。
(2)10mg/ml的溴化乙锭(EB)
(3)50TAE电泳缓冲液(pH约8.5):
Tris碱242g,57.1mL冰乙酸,37.2gNa2EDTA·2H2O,ddwater定容至1L。
使用时稀释成1。
(4)6×凝胶加样缓冲液
(5)电泳级琼脂糖粉
四、实验步骤:
1.制胶
(1)称取0.4g琼脂糖置于三角瓶中,加入50ml1×TAE电泳缓冲液。
(2)微波炉加热、煮沸、振摇,使琼脂糖全部熔化。
(3)将有机玻璃电泳槽洗净,两端分别用橡皮条紧密封住。
将封好的胶槽置于水平支撑物上,插上样品梳子。
梳子下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
(4)待胶冷却至60℃左右时,在胶液中加入溴化乙锭(EB)2.5μl。
将琼脂糖小心倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
(5)待胶完全凝固后,小心向上方拔出梳子,避免前后左右摇晃,以防破坏胶面及加样孔。
去掉制胶槽两边的橡皮条,小心将胶槽放入电泳槽中,样品孔在阴极端。
(6)向电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
2.上样电泳
(1)取5μL待测液与1μL载样液混匀,用移液枪小心加入样品槽中,每加完一个样品要更换一个枪头。
(2)加完样后,合上电泳槽盖,接通电源,控制电压60V-80V,电流40mA以上。
(3)当溴酚蓝条带移动到浸胶前言约2cm时,停止电泳。
3.凝胶紫外观察
在波长为254nm的紫外灯下观察,凝胶成像系统中照相、保存。
五、实验注意事项:
1.EB具有强诱变性,可致癌,必须带手套操作。
2.制胶和加样时要防止产生气泡。
3.凝胶方向要安放正确。
4.电泳时确保电泳槽已接通,观察电极气泡。
实验三PCR扩增获取目的基因
一、实验目的
1、了解:
PCR反应的基本原理和引物设计的一般要求;
2、掌握:
通过PCR反应获取目的基因的实验技术;
3、熟悉:
PCR反应体系的加样顺序和PCR仪的正确使用方法。
二、实验原理与方法:
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)简称PCR技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促反应。
分三步:
①变性,通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA;②退火,当温度降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多,而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链,而模板DNA双链之间互补的机会较少;③延伸,在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下,5′→3′的聚合酶催化以引物为起始点DNA链延伸反应。
以上三个步骤为一个循环,每一循环产物可作为下一个循环的模板,几十个循环后,介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制,可达2×106~7拷贝。
三、实验条件:
旋涡混合器,微量移液取样器,双面微量离心管架,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统。
移液器吸头、0.2mLPCR微量管分别高压灭活。
上游引物:
5′-ATGGC(A,T)AC(A,T)TGGAA(A,G)GTTG-3′;
下游引物:
5′-GT(A,T)GCACT(G,A)CA(A,T)AT(T,C)TGACC-3′。
四、实验步骤:
1在0.2mL离心管管内配制50μL反应体系:
(1)ddH2O38μL
(2)10×buffer5μL
(3)dNTP1μL
(4)Taq酶1μL
(5)引物P11μL
(6)引物21μL
(7)模板DNA3μL
2按下列程序进行扩增:
(1)94℃预变性5分钟;
(2)94℃变性50秒;
(3)55℃退火50秒;(4)72℃延伸10秒;
(5)重复步骤②-④30次;
(6)72℃彻底延伸10分钟。
3琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
五、实验报告要求
。
绘出PCR电泳图
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化
一、实验目的:
1、学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
2、学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。
二、实验原理与方法:
带有外源DNA的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,,该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法(如:
CaCl2,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA的载体分子通过。
将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域,这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态;此时加入DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外表面上;经短暂的42℃热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内。
三、实验条件:
1.器材
旋涡混合器,微量移液取样器,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,接种环,恒温培养箱,0.22μm细菌滤器。
摇菌试管、三角烧瓶、培养皿、移液器吸头和1.5mL、0.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。
4.试剂
(1)LB培养基:
胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加200mLddwater搅拌完全溶解,用约200L5NNaOH调pH至7.0,加ddwater至1L,121C20min灭菌。
使用时可加入氨苄青霉素,终浓度100g/mL。
(2)氨苄青霉素储存液:
无菌水配制100mg/mL,每管200μL分装到0.5mL微量离心管中,-20C保存。
(3)LB平板培养基:
LB培养基中含14%琼脂,高压灭菌后加入氨苄青霉素至100μg/mL,每个培养皿中约15mL倒制平板。
(4)无菌ddwater
(5)20%(M/V)IPTG:
无菌水配制,过滤灭菌。
(6)2%(M/V)X-gal:
用N,N-二甲基甲酰胺配制,过滤除菌,铝箔封裹避光-20C保存。
(7)0.1mol/LCaCl2溶液,121C20min灭菌后存放在冰箱。
3.材料
感受态细菌,质粒
四、实验步骤:
1.感受态细胞的制备:
1)取一支无菌的摇菌试管,在超净工作台中加入2mLLB培养基(不含抗菌素!
)。
从超低温冰柜中取出DH5菌种,放置在冰上。
在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中,然后接入含2mLLB培养基的试管中,37℃摇床培养过夜。
2)取0.5ml菌液转接到一个含有50mLLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养2-3h。
3)将菌液转移到1.5mLEP中,冰上放置10min,4℃离心4000rpm10min。
4)倒出培养液,将管倒置1min,使培养液流尽。
5)用冰冷的0.1mol/LCaCl2300μL悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。
6)离心10min(4000r/min),回收细胞。
7)用冰冷的0.1mol/LCaCl250μL悬浮细胞(放在冰上)。
8)取50μL新配制的感受态细胞,加入质粒DNA2μL混匀,冰上放置30min。
同时做两个对照:
受体菌对照:
50μL感受态细胞+2μL无菌水
质粒对照:
50μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA
9)将管放到42℃循环水浴1-2min。
10)冰浴2min。
11)每管加200μLLB液体培养基,37℃培养45min。
12)将250μL转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的培养皿中。
13)倒置平皿37℃培养12~16h,出现菌落。
14)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。
五、思考题
1.制作感受太菌的过程中,应注意那些关键步骤?
2.CaCl2溶液的作用是什么?
为什么要冰冷的?
3.影响转化效率的因素有哪些?
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 实验 指导书 剖析
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)