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米糠中γ氨基丁酸的富集检测与分离
米糠中γ―氨基丁酸的富集、检测与分离
摘要:
米糠是稻谷加工中的副产品,年产量很大但开发利用程度很低,从副产品综合利用方面看,米糠中提取制备γ―氨基丁酸具有重要作用。
本文综述了从米糠中提取高浓度γ―氨基丁酸的富集、检测与分离技术。
关键词:
γ―氨基丁酸、富集、检测、分离
TheEnrichment,DetectionandSeparationofγ-aminobutyricacidinRiceBran
Abstract:
Ricebranwasimmobilizedbysodiumalginatetoproduceγ―aminobutyricacid(GABA).Thispaperreviewstheenrichment,detectionandseparationtechnologyofγ-aminobutyricacidinRiceBran.
Keyword:
γ-aminobutyricacid,enrichment,detection,separation
γ―氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)是由谷氨酸(Glutamicacid,Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase,GAD)催化转化而来,是存在于哺乳动物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质,对生物体生命活动的调节起着不可替代的作用。
中国素来以“稻米王国”著称,稻谷年产量占世界稻谷总产量的35%左右,居世界首位。
稻米加工副产品之一米糠,资源丰富、价格低廉,由于其含有的谷氨酸脱羧酶活性高,因此将米糠开发成富含GABA食品不仅成本低,而且可以使这个“传统饲料”极大增值,变废为宝。
本文综述了近年来从米糠中富集、检测以及分离γ―氨基丁酸的技术。
1.γ―氨基丁酸的发现
GABA作为一种化学物质来说,早在1883年已被人工合成。
其后又做过一些在真菌、细菌和植物中代谢的研究。
直到1950年,Roberts和AwaPara各自发现了GABA存在于神经组织中。
他们发现葡萄糖是脑内GABA的重要来源,它的直接前体是谷氨酸。
谷氨酸经谷氨酸脱按酶(GAD,需维生素B为辅基)脱羧生成GABA。
GABA的降解是经GABA转氨酶将它的氨基转移给a―酮戊二酸,最后生成谷氨酸和琥珀酸。
a―酮戊二酸和琥珀酸是三羧酸循环中两个重要的中间产物。
Floreyt按另一条途径从牛脑中萃取了一种含有某些未知物的溶液。
这种提取液能抑制鳌虾牵张感受器神经元产生冲动并阻断乙酸胆碱对豚鼠及家兔回肠的收缩作用。
他把这种未知物称为抑制因子,肝、脾、心脏或外周神经的提取液则没有这种抑制因子样作用。
Killam等报道酞肼类化合物所以能产生惊厥作用,是因为它们能对抗维生素B的作用,导致脑内GABA水平的下降;而且,几百名婴儿吃了缺乏维生素B.的食物后发生惊厥的原因就在于此。
本着这种设想,Bazemore等用抑制鳌虾牵张感受器神经元的放电作为测试指标,比较了经离子交换树脂柱层析得到的抑制因子各组分抑制作用的强弱,证明抑制因子中起明显抑制作用的组分就是GABA。
化学合成的GABA能产生相同的抑制效应,而其他45种氨基酸的抑制作用均显著低于GABA。
Bazemore等的工作证实,在哺乳动物中枢等部位,GABA具有普遍的抑制作用,从而引起了神经科学工作者对GABA的高度重视。
1959年在美国加利福尼亚州举行了首次有关GABA的国际性讨论会。
GABA具有抑制作用,它的代谢过程和它与惊厥的发生有关都得到了与会者的肯定。
1960年梅镇彤等的实验结果表明,向兔一侧视区皮层应用微量GABA(100μg)后,由光刺激对侧眼建立的阳性条件反射首先受到短暂的抑制,但非条件反射则不受影响。
把GABA注于侧脑室,无论对条件或非条件反射均无影响[1]。
2.GABA的体内循环:
GABA分子式为C4H9NO2,相对分子量103.12,结构式:
GABA易溶于水,其pK1=4.03,pK2=10.56,等电点为pI=7.295。
GABA可以与茚三酮在弱酸性溶液中共热,生成紫红色化合物,该产物在512nm处有最大吸收,是定性鉴别和定量测定的重要依据[2]。
高等植物中的GABA主要是由L―谷氨酸脱羧而来。
Streeter和Tompson用14C谷氨酸处理萝卜叶子,结果有大量14C的GABA形成,这表明GABA来源于谷氨酸的脱羧反应,具体的说就是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(GAD)的作用下,谷氨酸不可逆的脱去α位上的羧基形成GABA。
和其他生物一样,植物中GABA首先在GABA转氨酶的作用下与a―酮戊二酸发生转氨作用,形成谷氨酸和琥珀酸半醛,琥珀酸半醛经脱氢氧化形成琥珀酸,进入三羧酸循环。
这些反应和a一酮戊二酸氧化成琥珀酸的反应一起构成GABA支路(详见下图)。
在许多植物组织的粗提液中,谷氨酸脱羧酶都具有活力,该酶以L―谷氨酸为底物,5―磷酸吡哆醛为激活剂,并且具有钙调素结合区域,能够与巯基反应的抑制剂会抑制其活性,其最适作用pH为5.8[3][4]。
3.γ―氨基丁酸的生理功能
3.1降血压作用:
GABA能系统对脑血管进行调节,是目前研究的重要课题之一。
已有实验证明,在几种动物(猫、犬和大鼠等)的脑血管中有GABA能神经支配系统,而且GABA能系统还参与脑循环的调节。
GABA能使脑部血液流畅,氧供给增加,脑细胞功能亢进。
因此临床上常作为脑血栓后遗症、脑动脉硬化症等造成的头痛、耳鸣、记忆障碍、情绪冷漠等症状的改善药使用。
另一方面,它作用于延髓的血管运动中枢,使血压降低,同时抑制抗利尿激素后叶加压素的分泌,扩张血管,降低血压。
而且GABA还有肾功能活化功能,高血压病人往往肾功能降低,使肾功能活化后,即使盐分摄取量增多,也可因为利尿作用激活,过剩盐分可从尿中排出,使血压降低,从而可预防高血压[5]。
3.2GABA有助于抗衰老
中国科技大学、中科院昆明动物研究所和美国犹他大学的科研人员合作研究发现,大脑中神经递质——GABA的减少可能是脑衰老的一个原因。
科研人员通过对短尾猴进行研究后发现GABA能帮助神经细胞处于对信号识别的高能力状态。
但他们并没有在人类身上进行试验。
该发现预示着如果能够通过某种手段提高人大脑中GABA的含量,则有可能改善老年人的感觉功能以延缓衰老,而这一预示于2003年被Leventhal等证实,GABA确与脑衰老有关[2]。
3.3调节心律失常的作用
GABA能系统参与哺乳动物(包括人类)心血管功能调节,可抑制心律失常的发生。
阻断中枢GABA能系统则产生心律失常,说明中枢GABA能系统在心律失常发生中起着重要的作用。
有研究发现外源性的GABA具有抗心律失常活性,可对抗多种实验性心律失常。
进一步研究认为,GABA主要通过对心脏的直接作用而抗乌头碱性心律失常,与神经调节无关。
3.4治疗精神疾病
兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸比例失调,导致兴奋作用增强,抑制作用减弱,是癫痫发病的重要原因之一.许多神经生理学研究表明GABA介导的抑制性传导异常或缺失是癫痫发作时神经元高兴奋性的主要原因.在癫痫病人手术切除的脑组织癫痫灶中GABA水平减低,癫痫患者脊髓液中GABA的浓度也低于正常水平。
在遗传缺陷型癫痫鼠的丘脑中GABA摄入比正常个体的少.Amabeoku等也发现促进GABA神经传递的物质可以减缓癫痫病症,能抑制GABA神经传递的物质则加重癫痫的症状.GABA及其受体与癫痫的关系已广泛研究,目前的研究重点是GABA受体及GABA转运体与癫痫之间的相互关系[6]。
4.从米糠中富集GABA
初期,从植物中富集提取GABA的原料主要为稻米。
由于稻米原料资源广,价格低廉,将其开发成GABA类食品不仅成本低,而且稻米中的GAD活力高,产品中的GABA含量远远高于其它植物中能够达到的GABA富集量。
NorikoKomatsuzaki等[7]研究了对发芽糙米中GABA富集的方法。
经过在浸泡3h、气调处理21h,发芽糙米(大胚芽)中γ―氨基丁酸的含量增加到24.9mg/100g。
由于相对于稻米富集GABA而言,米糠富集GABA无疑成本更低,应用前景更加广泛。
在从稻米副产品―米糠中提取γ―氨基丁酸方面,江南大学研究的较深入。
由于稻米经过水浸泡后,游离氨基酸中GABA大幅度提高,而且GABA的变化主要是在胚芽部分发生。
2004年张晖等[8]研究了利用米胚芽中得谷氨酸脱羧酶转化谷氨酸制备γ―氨基丁酸(GABA)的方法。
在米胚缓冲液(0.08mol/L、PH5.6的磷酸缓冲液)料液比为1:
10,脱羧酶辅基PLP和激活剂CaCl2的添加量为2mmol/molGlu和20mmol/molGlu,米胚芽和谷氨酸钠之比为500g/mol下40℃反应6小时,米胚芽谷氨酸可以将添加的谷氨酸全部转化为GABA,转化率达到100%,米胚芽中的GABA为20.6g/100g。
2005年陈颖等[9]分别通过水提法,外添谷氨酸,外加蛋白酶水解米糠蛋白富集γ―氨基丁酸。
通过单因素,正交试验得到水提法最佳富集工艺条件是:
温度40℃,pH5.2料水比为1∶9,时间9h,GABA的产量提高到276.6mg/100g米糠,Ca2+浓度达30mg/L时,GABA的含量可达420.3mg/100g米糠。
外添谷氨酸法最佳富集工艺条件是:
温度40℃,料水比为1∶8,pH5.6,时间8h,GABA的产量达922mg/100g米糠,并利用Ca2+和PLP激活GAD(谷氨酸脱羧酶),使米糠中的GABA的量提高到1600mg/100g米糠。
外加蛋白酶水解米糠蛋白富集最佳富集工艺条件是:
料液比1∶9,温度为50℃,时间为5h,pH8.0,Glu的含量可达5.694mg/g米糠,Glu的水解率为28.21g/100g。
水解液中米糠加入量为10g/L,GABA的产量达到370.5mg/100g米糠。
2007年马晓博等[10]比较了直接法与“提酶法”富集米糠γ―氨基丁酸(GABA)进行了比较,结果表明提酶法进一步提高了GABA的产率并且成本几乎没有增加。
“提酶法”即先提取米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)粗酶液之后再加入谷氨酸钠来富集GABA,产率达到3789.1mg/100g米糠。
之后作者展望了采用固定化酶的方法固定化GAD粗酶液中的GAD,从而不仅很大程度上提高GAD的利用率,更方便了后期GABA的纯化工作,适合工业化生产要求。
2009年王筱婧等[11]研究发现,可以将米糠固定化以达到固定化其中GAD的目的。
本文研究了固定化后的米糠中GAD的酶学性质,得到最佳固定化条件:
细米糠用量6.0%、海藻酸钠溶液浓度2.5%、硬化时间1h、CaCl2溶液浓度1.0%。
并通过固定化米糠GAD酶学性质的研究,发现经海藻酸钠固定化米糠GAD的最适温度由40℃移至45℃。
此时固定化米糠GAD酶活力回收率达到51.00%。
利用固定化米糠GAD制备的GABA制备液中GABA含量为3.06%,为植物法制备GABA提供又一种技术方法。
2011年管娜娜等[12]以米糠为原料,利用米糠中高活性谷氨酸脱羧酶(GAD)进行γ―氨基丁酸(GABA)的富集实验。
添加0.02mol/LpH5.6的Na2HPO4―柠檬酸缓冲液,料液比1∶8,维生素B65mmol/mol谷氨酸钠,CaCl210mmol/mol谷氨酸钠,底物浓度0.05mol/L,40℃水浴反应16h后灭酶、离心、微滤、超滤后得到富集液中GABA浓度2900mg/100g,谷氨酸转化率达72%。
5.米糠中GABA的检测方法
目前关于GABA的测定近年来国内外有酶法、色质联用法、柱层析荧光测定法、纸电泳比色、毛细管气相色谱法、放射性受体法、毛细管电泳法,改良纸层析法、比色法以及液相色谱法等。
而其中应用与谷物中γ―氨基丁酸检测方法主要为比色法、纸层析法、氨基酸自动检测仪以及液相色谱法。
其他方法大多用于医学领域,且价格昂贵,不适用于大量的定量分析。
5.1比色法
由于GABA对紫外、可见光的不灵敏性,用直接方法对它进行测定比较困难,因此比色法测定γ―氨基丁酸的原理则是应用Berthelot反应。
Berthelot反应是利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应,生成有色物质用来测定不同体系中微量氨及其盐类。
在该方法中ω―氨基酸的反应灵敏,而α―氨基酸响应低。
对于GABA和常规氨基酸来讲,它们在Berthelot反应中的响应差别悬殊,其中GABA有很高的响应,故该方法具有极高的灵敏度。
陈恩成等[13]利用该原理研究出了快速测定糙米中γ―氨基丁酸含量的比色法。
糙米或发芽糙米粉以60%乙醇溶液为溶剂,在70℃温度下回流提取2h,其离心上清液以重蒸苯酚和次氯酸钠溶液作为显色剂显色反应,在645nm处比色测定,以标准品为对照可以计算样品中γ―氨基丁酸含量。
该方法简单、快速、经济,相对标准偏差(RSD)为0.98%,平均回收率为99.4%,适合于大量稻米品种中γ―氨基丁酸的定量分析。
5.2纸层析法
除了比色法外,另一种快速、简单的方法为纸层析法。
张晖等[14]测定米胚芽富集GABA后的含量时,将不同工艺富集的米胚芽液于沸水中煮沸5min,离心分离,取上清液用纸层析法测定。
所用的展开剂V(正丁醇):
V(醋酸):
V(水)=4:
1:
3、用0.4g/dL茚三酮在90℃下显色10min、洗脱剂V(1g/L硫酸铜)∶V(体积分数75%乙醇)=2∶38洗脱后10―50min用比色法定量测定GABA含量。
对该方法在点样量8―40μg时呈线性关系,相关性系数R2=0.9986。
从而建立起米胚芽中γ―氨基丁酸分离、测定的纸层析方法,该方法简便易行,耗费低廉,可广泛应用于其它食品分析。
5.3色谱法
由于食品中成分较为复杂,其他物质容易干扰GABA的测定,从而降低检测的精确性和灵敏度。
因此为了提高谷物中GABA含量检测的灵敏度和准确性,可采用高效液相色谱法。
由于GABA在快速加热时易分解,故在上柱前需要衍生化。
现有常用的衍生剂主要有邻苯二甲醛(OPA)、异硫腈酸苯脂(PITC)和2,4-二硝基氟苯(FDNB)。
而OPA是衍生物不稳定,需快速进样。
PITC衍生化需在严格无水条件下进行,均给此类衍生剂的使用带来了一定的不利因素。
由于FDNB与氨基结合牢固,所以FDNB与氨基酸反应时,不易被水解,衍生产物相当稳定,是进行柱前衍生的理想试剂。
郑洪建等[15]以富含γ-氨基丁酸(GABA)的大豆胚芽乳、黄酒、有机糙米、绿茶和杨梅为研究对象,采用2,4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生和等度洗脱,建立一种快速测定γ-氨基丁酸含量的RT-HPLC方法。
该方法简便,分析时间短(<7min),灵敏度高,稳定性和重现性好。
优化后色谱条件如下:
HypersilODS2C18,流动相为乙腈∶水∶磷酸盐缓冲液(pH=7.2,体积比为20∶20∶60),检测波长为360nm。
在最适条件下,γ-氨基丁酸的线性检测范围为0.016~1.000mg/mL,线性关系良好,回收率为96.5%~104.0%。
此外,房克敏等[16]采用AQC(6―氨基喹啉基―N―羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯)为柱前衍生试剂也到了较好的效果。
在AQC中,带有羟基琥珀酰亚胺反应活性基团的氨基甲酸酯是迅速定量衍生氨基化合物的关键,由于其能迅速水解生成6―氨基喹啉而失活,故可限制非期望的副反应的发生。
衍生产物中的喹啉基团是提高检测灵敏度的关键,生成在室温下可稳定一周的高稳定性的脲,衍生物经HPLC分离后经紫外检测器检测,可得到理想的结果。
在其测定16种发芽糙米中GABA含量的实验中,当其他条件为WatersAccQ·Tag氨基酸分析柱,梯度洗脱,紫外检测波长248.0nm时,得到的γ―氨基丁酸的线性范围在0.10~1.0μmol/ml,线性关系良好,线性方程为Y=3.0×106X―7877.6,r=0.9999,回收率为99.0%~100.5%。
该方法易于操作、稳定、灵敏、准确。
5.4氨基酸分析仪法
对于氨基酸分析仪法,其虽可提供准确、高灵敏度的测定方法,但常规的生理体液分析方法耗时太长(130min),因此不利于大批量样品的快速分析以及临床监测。
钱爱萍等[17]用L―8800氨基酸分析仪30min短程序快速测定植物产品中的γ―氨基丁酸,并与53min标准程序的测定值进行比较,试验表明两种程序测定结果一致。
在30min短程序中,保留了原有的23min再生时间,γ―氨基丁酸的分析时间只设置7min(包括树脂的平衡)。
用γ―氨基丁酸标准品作精密度和回收率试验,结果表明:
峰位置重现性变异系数为0.17%,峰面积重现性变异系数为0.23%,回收率为97.89%~101.2%。
采用两种程序测定糙米和中药材中的γ―氨基丁酸,测定结果的相对误差小于3%。
该改良方法稳定、快速、准确,适于γ―氨基丁酸的测定。
6.米糠中γ―氨基丁酸的分离
6.1膜分离技术:
膜技术由于不会应高温或化学因素而破坏有效成分,可较好地保持物料的原有成分及其活性,产品质量高,故可以将其用于分离米糠中GABA。
管娜娜等[1]采用D001大孔强酸性阳离子交换树脂对该米糠富集液进行纯化实验,调节富集液pH2.0,以2mg/mL的浓度上样吸附,2mol/L的氨水浓度进行洗脱,最终可得γ-氨基丁酸纯度61.25%。
陈颖等[8]将米糠GABA富集液,通过用50nm孔径的无机陶瓷膜除去蛋白质等大分子物质,用700mL/L酒精去除多糖,再通过500D的复合有机膜进一步纯化GABA,使GABA占固形物的含量从5g/100g上升到20g/100g,纯度提高了4倍。
由于膜分离技术产品收率较低,故可以将其与其他方法结合起来。
王文等[18]先采用高速离心对发酵液成分初步分离,然后运用超滤和稀释过滤相结合的方法,在去除大分子的同时,尽量提高GABA的回收率。
用分子切割量为50000D的PES膜组件进行试验,研究了各操作参数的影响,得到优化参数:
温度低于40℃,压差0.2MPa,循环流速0.5m/s,pH=5。
因超滤后GABA的回收率较低,故采用稀释过滤,以提高回收率。
在两次间歇式稀释过滤后,GABA的回收率由原来的50%提高到将近95%,达到较好的分离效果。
从中可以看到米糠富集液也可以用超滤和稀释过滤结合的方法,在得到纯度的同时提高收率。
6.2离子交换
卢卫国等[19]采用固定化谷氨酸脱羧酶转化谷氨酸生成γ―氨基丁酸,从4种阳离子交换树脂中筛选出交换容量最高的D061型,用于分离谷氨酸转化液中的γ―氨基丁酸。
用静态和动态的方法,考察了不同操作条件对固定床离子交换效果的影响。
结果表明,D061型树脂最佳吸附条件为pH=4.0,温度40℃,平衡吸附时间17min,吸附量为0.83mol/L。
谷氨酸转化液上样的最佳流速为1BV/h。
洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L,最优流速为1BV/h。
经旋转蒸发仪浓缩、醇沉结晶后,可得γ―氨基丁酸样品,其回收率达到80%。
样品由X射线衍射图谱进行了验证。
马晓博[2]利用乙醇沉淀法对GABA富集液进行初步分离处理,得到75%的乙醇浓度对GABA富集液中蛋白质和多糖的沉淀效果显著,沉淀率达到90%以上,且GABA的损失率较小,表明乙醇沉淀法适用于GABA富集液的初步分离。
LSA―8B大孔吸附树脂是一种高效、选择性吸附纯化树脂,对蛋白质、糖和色素有较好的吸附,且GABA回收率较高,适用于GABA富集液的纯化。
其研究考察了吸附过程中的影响因素,确定最佳条件为:
采用预处理液调pH值至5.0,上柱流速为2BV.h―1,以脱除蛋白质、色素和部分多糖等杂质;流出液调pH值至8.0,上柱流速为1BV.h―1,脱除糖等杂质。
其之后对提酶法和固定化米糠制备的GABA的富集液分离实验,发现提酶法制备的GABA富集液经纯化后,GABA含量由初始的4.76%提高到13.90%,GABA回收率为75.52%。
由固定化米糠制备的GABA富集液中蛋白质和糖含量低,可以直接用LSA―8B大孔吸附树脂处理,处理后GABA含量由3.06%提高到4.04%,GABA回收率为98.06%。
6.总结与展望
GABA作为活性因子,具有良好的生理活性,将其应用于功能性食品中将大有可为。
虽然GABA在自然界的分布很广泛,但GABA含量都很低。
而米糠作为稻米加工的副产品,其原料来源广泛,并且其中含有的GABA和对应的转氨酶活性高。
因此将米糠作为γ―氨基丁酸的原料制备GABA就有广阔的应用前景。
目前,关于米糠富集的技术研究的比较多,而对于如何高效的提取、分离研究的较少。
故以后可主要从提取和分离入手,并与先前的研究结合起来,研究出一整套的工艺路线,提高米糠的综合利用。
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