浅论C型产气荚膜梭菌α.docx
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浅论C型产气荚膜梭菌α
浅论C型产气荚膜梭菌α
【摘要】 目的研究含α-β2-β1融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)的免疫原性。
方法用重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)制备包涵体和全细胞培养物两种抗原,采用氢氧化铝胶体作为免疫佐剂,免疫ICR小白鼠,用C型产气荚膜梭菌外毒素粗提物进行攻毒,观察小鼠的保护情况。
结果包涵体加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%;全细胞培养物加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒达到50%和20%。
结论已获得具有一定免疫原性重组菌株,可作为预防C型产气荚膜梭菌所致疾病的候选菌株。
【关键词】C型产气荚膜梭菌融合蛋白免疫保护
Abstract:
ObjectiveToexploretheimmunogenicityofalphatoxin、beta2toxinandbeta1toxinfusiongeneintherecombinantstrainBL21(DE3)(pXETAB2BZ)ofClostridiumperfringenstypeC.MethodsInclusionbodyandthestraincultureofrecombinantstrainBL21(DE3)(pXETAB2BZ)weremadeandthealuminumhydroxidehydrateandFreund‘sadjuvantwereaddedasadjuvantrespectively.ICRmousewasimmunizedwithdifferentantigensandchallengedwithexotoxinofClostridiumperfringenstypeC.Immunogenicityoftherecombinantstrainwereobservedinmice.ResultsImmunizationwithinclusionbodycontainingaluminumhydroxidegelcouldprotectICRmousefromthechallengeof1LD100and2LD100.Theprotectiverateofthestrainculturecontainingaluminumhydroxidegelwas70%and20%fromthechallengeof1LD100and2LD100respectively;TheinclusionbodyandthestrainculturecontainingFreund‘sadjuvantwas50%and10%fromthechallengeof2LD100ofClostridiumperfingensCtypetoxin.ConclusionTherecombinantstrainBL21(DE3)(pXETAB2BZ)hadimmunogenicityandcouldbeusedascandidatestrainofvaccination.
Keywords:
clostridiumperfringenstypeC;protectiveantigen;immunogenicityt
C型产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens),又称魏氏梭菌(C1welchii)是一类重要的人兽共患病的病原体,是引起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌,易导致新生幼畜和幼禽(尤其新生仔猪)高致病性和高病死率。
长期以来一直认为C型产气荚膜梭菌只产生主要的毒力因子α和β毒素(现称β1毒素),并做了许多研究[1-5]。
近年来又发现另一种毒力因子即β2毒素[6]。
免疫佐剂是与抗原混合注射于动物体内,能非特异性的改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的一种物质。
本实验将含α-β2-β1融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)优化[7]后,进一步制备抗原,并配以氢氧化铝胶体作为免疫佐剂,免疫ICR小白鼠,再用C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2外毒素攻毒,观察免疫保护情况。
1材料与方法
菌株
基因工程菌株BL21(DE3)(PXETAB2BZ)系作者[8]构建和保存;C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存。
实验动物
18~20gICR小鼠(雌雄各25只)购于宁夏医学院实验动物中心(合格证号SCXK(宁)2005-0001)。
氢氧化铝胶体免疫佐剂的制备
氢氧化铝200g,氯化钠,蒸馏水加至1000mL,完全混合均匀后双层纱布过滤2次,×105Pa高压灭菌60min备用。
菌种的复壮
在预先准备好的含50mg/mLKan的LB平板上,接种环划线冻存的BL21(DE3)(PXETAB2BZ)菌种,倒置于37℃培养箱中培养12~16h后,挑取单个菌落,接种于含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃振荡培养12~16h后备用。
免疫用抗原的制备
包涵体粗提物抗原的制备
将IPTG诱导5h的50mL培养物离心收集菌体,然后重悬于mL1%Tris-HCl-2mmol/LEDTA中,加入溶菌酶至终浓度100μg/mL,再加入mL1%TritonX-100,于30℃温浴15min。
超声波处理10s后再超声波处理10s,12000r/min离心15min,收集的沉淀物即为包涵体粗提物。
将该包涵体重溶于20mL的生理盐水中,超声波处理10s后再超声波处理10s,12000r/min离心15min,收集沉淀重溶于6mL的生理盐水中,分装于6支离心管中,备用。
将制备的包涵体粗提物1支用灭菌生理盐水10倍稀释后,加入氢氧化铝凝胶至终浓度10%,经无菌检验后作为免疫用抗原。
重组菌全细胞培养物抗原的制备
挑取LB平板的单个菌落,接种于5mL含30μg/mLKan的LB试管中,于37℃振荡过夜。
次日取1mL接种于100mL含Kan的LB三角瓶中(1%接菌量),于37℃振荡16~24h后加入%甲醛灭活3d后,取50mL按10%加入氢氧化铝凝胶佐剂,经无菌检验后作免疫用抗原。
免疫接种实验
取小鼠50只,随机分成5组,每组10只(每组雌雄各5只),第一组和第二组皮下注射用包涵体加铝胶制备的抗原(),第三组和第四组皮下注射含工程菌全细胞培养物加铝胶制备的抗原(),第五组皮下注射生理盐水()作为对照。
间隔14d进行二免。
二免14d后用C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)进行攻毒,每天观察小白鼠死亡情况。
C型产气荚膜梭菌毒素的制备
将C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)接种于肝片肉汤厌氧培养基中,37℃过夜培养,4℃5000r/min离心20min后以μm微孔滤膜过滤除菌,即为毒素粗提物,临用前以无菌生理盐水稀释10倍,作为攻毒毒素。
C型产气荚膜梭菌作用于ICR小鼠LD100的测定
将毒素粗提物用灭菌生理盐水稀释10倍后以不同剂量(、、、、、mL)分别腹腔注射6组ICR小鼠,每组4只(每组雌雄各2只),48h后观察各组小鼠的死亡情况,确定ICR小鼠LD100。
攻毒试验
将C型产气荚膜梭菌毒素粗提物以1LD100剂量对第一和第三组免疫小鼠进行攻毒,以2LD100剂量对第二和第四组免疫小鼠进行攻毒,同时以1LD100剂量注射对照组小鼠,48h后观察各组小鼠死亡情况,观察免疫保护效果。
2结果
C型产气荚膜梭菌毒素LD100的测定
由表1可以确定C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)毒素对ICR小鼠的LD100为mL(C59-2毒素原液剂量)。
表1C型产气荚膜梭菌毒素LD100测定表2免疫原性实验结果
重组菌株的免疫原性实验
3讨论
C型产气荚膜梭菌属腐生性厌氧芽胞致病菌,在土壤中广泛存在,享有广泛的疫源地,因而对我国畜牧业生产构成严重威胁,全国各地仔猪红痢的发病率呈上升趋势,兼有很高的死亡率。
本病的主要致病因子为菌体产生的α和β毒素,其中β2毒素是1997年才确认的一种新的坏死性、致死性毒素[6]。
与β1毒素一样,β2毒素也是引起人和动物坏死性肠炎的重要致病因子之一。
业已证实,β2毒素的基因序列与β1毒素、α毒素及其它已知的产气荚膜梭菌毒素的序列没有明显的同源性,但却有相似的生物学活性[9]。
抗β2毒素的抗体能识别纯化的β2毒素,并能与β1毒素发生弱反应,相反,抗β1毒素的抗体只能与β1毒素反应,而不能与β2毒素反应,表明二者的免疫相关性差,其机理尚不清楚[9]。
而α毒素是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶,具有磷脂酶C(PLC)和鞘磷脂酶两种酶活性,能同时水解组成细胞膜的主要成分—磷脂酰胆碱和鞘磷脂,破坏细胞膜的完整性,导致细胞裂解,从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。
结果表明,用制备好的融合蛋白免疫ICR小白鼠后,包涵体加氢氧化铝凝胶的保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%,表明C型产气荚膜梭菌保护性抗原基因重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)能够表达α-β2-β1融合蛋白,并且该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,从而达到对C型产气荚膜梭菌攻毒保护的目的。
全细胞培养物加氢氧化铝凝胶抵抗的保护效果对于1LD100达到50%,2LD100达到20%。
全细胞培养物的保护率未达到预期效果,分析原因可能是由于外源基因较大,在不加诱导剂的情况下不能很好的得到表达,且不能很好地释放至菌体外,从而降低了重组菌株的保护率。
【参考文献】
[1]WilliamsonED,TitballRW.Ageneticallyengineeredvaccineagainstthealpha-toxinofclostridiumpenfringensprotectsmiceagainstexperimentalgasgangrene[J].Vaccine,1993,11(12):
1253-1258.
[2]HunterSE,Cand geneticanalysisofbeta-toxinofclostridiumpenfringensrevealssequencehomologywithalpha-toxin,gamma-toxin,andleukocidinofstaphylococcusureus[J].HnfectImmun,1993,61(9):
3958-3965.
[3]SteinthorsdottirV,FridriksdottiV.Site-directedmutagenesisofclostridiumpenfringensbetatoxin expression ofwild-type andmutantoxinsin Bacillussub-titis[J].Microbiol,1998,158:
17-23.
[4]许崇波,赵宝华,卫广森,等.产气荚膜梭菌α-β融合基因的高效表达[J].中国预防兽医学报,2001,23(5):
356-358.
[5]王玉炯,邓光存,曾瑾,等.产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析[J].宁夏大学学报(自然科学版),2004,25
(1):
63-65.
[6]MaryseGibert,ColetteJolivet-Renaud,etal.Beta2-toxin,anoveltoxinproducedbyClostridiumperfringen[J].Gene,1997,203:
65-73.
[7]韩学波,曾瑾,王玉炯.C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)表达条件的优化[J].宁夏医学杂志,2007,29(8):
675-677.
[8]韩学波,许崇波,曾瑾,等.产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因的构建及表达[J].中国生物制品学杂志,2006,19(9):
454-456.
[9]王玉炯.产气荚膜梭菌β毒素研究进展[J].宁夏农学院学报,1999,20(3):
74-78.
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- 浅论 型产气 荚膜