WB实验流程修订.docx
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WB实验流程修订.docx
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WB实验流程修订
1.细胞、组织总蛋白的提取:
1.1细胞总蛋白提取:
弃去细胞培养板中的液体培养基,用3ml4℃预冷的PBS(0.01MpH7.2~7.3)(平放轻轻摇动1min)洗两次。
加入细胞裂解液RIPA(6孔板,每孔40μl),冰上震荡裂解30min,待细胞裂解完成,用细胞刮将细胞刮下,将裂解液全部吸入1.5mlEP管中,4℃,15000rpm离心15min,用移液器吸取上清液至另一个1.5mlEP管中。
按体积分装保存于-80℃,避免反复冻融。
取2uL用于浓度测定蛋白质浓度。
1.2组织总蛋白提取:
50-100mg液氮保存组织,于液氮预冷的研钵中研磨成粉,转入1.5mlEP管中,加入细胞裂解液RIPA,震荡裂解30min,待细胞裂解完成,将裂解液全部吸入1.5mlEP管中,4℃,15000rpm离心15min,用移液器吸取上清液至另一个1.5mlEP管中。
按体积分装保存于-80℃,避免反复冻融。
取2uL用于浓度测定蛋白质浓度。
2.BCA法测蛋白质浓度:
2.1BCA工作液配制:
按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:
1)配置适量(根据测定蛋白所需量)BCA工作液,充分混匀;(0-7孔需1600ul,再加上样本量×200ul)
2.2蛋白标准工作液配制:
将蛋白标准储存液(5mg/ml)用双蒸水5倍稀释,配成1mg/ml的工作液(0-7孔共需53ul---11ul:
44ul双蒸水);
2.3绘制标准曲线:
取一块酶标板,按试剂盒说明书加试剂,详见表2-2;
表2-2BCA法加样操作样表
Tab.2-2BCAoperationtableofaddingsample
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
8(样品)
蛋白标准溶液(ul)
0
1
2
4
8
12
16
20
0
去离子水(ul)
20
19
18
16
12
8
4
0
0
对应蛋白含量(ug)
0
1
2
4
8
12
16
20
?
BCA工作液(ul)
200
200
200
200
200
200
200
200
200
8孔及其他样品孔加入20ul样品(2ul蛋白裂解液+18ul去离子水)
把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30min;
用酶标仪测定A562,以0孔为对照;
以蛋白含量(ug)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(ug),除以样品稀释液总体积(20ul),乘以样品的稀释倍数即为样本的实际浓度(单位:
ug/ul)。
(浓度为ng/ul),具体见Excel表格。
3.蛋白变性:
按1体积蛋白加1/4体积5*loadingbuffer配成混合液(可稍加热)在100℃沸水中煮5min,再重新计算蛋白浓度,置于-80℃保存。
4.洗板、固定玻璃板配胶:
备:
用清洁剂洗1.0mm板一块10孔、1.0梳子,去离子水洗净,晾干。
4.1玻璃板对齐,固定电泳架上,凡士林边条防止漏胶,螺帽交叉拧紧,加水观察是否漏水。
4.2配SDS—PAGE下胶,参照碧云天SDS-PAGE胶配制。
SDS-PAGE分离胶浓度
最佳分离范围
6%
50-150kD
8%
30-90kD
10%
20-80kD
12%
12-60kD
15%
10-40kD
下胶准备试剂:
30%Acr-Bis(29:
1):
29g丙烯酰胺(acrylamide),1gN亚甲双丙烯酰胺(N-N-Methylene)37℃溶解于60ml水,加水至100ml,过滤,PH不应大于7,4℃避光保存,使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。
如有沉淀,可以过滤。
1.5MTris,PH8.8:
Tris (MW121.14)45.43g 超纯水200ml溶解后,用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌,冷至室温后,用浓盐酸调pH至6.8,后室温下保存。
1MTris,PH6.8:
Tris (MW121.14)30.29g 蒸馏水200ml溶解后,用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌,冷至室温后,用浓盐酸调pH至6.8,后室温下保存。
10%SDS:
SDS(十二烷基硫酸钠SodiumDodecylSulfate)10g加蒸馏水至100ml,50℃水浴下溶解,室温保存。
如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
10%过硫酸铵:
过硫酸胺(AmmoniumPersulfate)0.1g加超纯水1.0ml吹打溶解后,4℃保存,保存时间为1周。
0.5mol/LTris·HCl(pH6.8):
Tris(MW121.14)15.14g超纯水200ml溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
成分(分离胶)
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分体积(毫升
10%胶(新配,4°保存一周)
6
10
蒸馏水
2.3
2.7
30%Acr-Bis(29:
1)
2.03
3.3
1.5MTris,PH8.8
1.55
3.8
10%SDS
0.06
0.1
10%过硫酸铵(APS)
0.06
0.1
TEMED
0.0024
0.004
加TEMED前提前准备好1ml枪(混匀并灌胶用),否则胶很快凝注。
4.3用水2ml封线,下胶凝固(20分钟,观察水封线以下有明显界面)后倒去水
4.4配上胶
成分(积层胶)
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分体积(毫升)
5%胶
2
3
4
6
蒸馏水
1.4
2.1
2.7
4.2
30%Acr-Bis(29:
1)
0.33
0.5
0.67
1.0
1MTris,PH6.8
0.25
0.38
0.5
0.75
10%SDS
0.02
0.03
0.04
0.06
10%过硫酸铵
0.02
0.03
0.04
0.06
TEMED
0.002
0.003
0.004
0.006
上胶凝固约20分钟。
4.5插入梳子(避免产生气泡),再从玻板,侧面补入少量上层胶,凝固约20分钟。
4.6先加下槽液,再加上槽液,然后再拔梳子。
5.电泳液(常温储存)的配制:
成份
1000ml
2000ml
Tris
3.03g
6.0g
甘氨酸
14.5g
29g
SDS
1g
2g
蒸馏水
1000ml
2000ml
6、上样:
上样:
每孔加入蛋白样品和蛋白Marker(蛋白20~25μl,Marker5μl)。
加足够的电泳液后开始准备上样。
(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
7、电泳:
加样完后,将上槽(黑色电极)接负极,下槽(红色电极)接正极,打开直流电源,80v电压跑上胶30min, 改用120v跑下胶90min(观察各条带变化而定,上胶稍分开下胶时,蓝色染料到达约胶底处附近,即停止电泳。
电极黑对黑,红对红)
8、切胶转膜(此操作在转膜液中进行—湿转)
8.1取出胶板,小心撬开一侧玻板,切除多余胶,分别切下目的条带。
8.2转膜液的配制:
1000ml
成份
1000ml
Tris
3.0g
甘氨酸
14.4g
SDS
0.37g
蒸馏水
加至800ml
甲醇
200ml
8.3滤纸、PVDF膜准备:
用尺子测量目的蛋白所在的条带,根据胶的大小剪取合适比例的滤纸和膜,将PVDF膜浸入甲醇1-3min(活化PVDF膜)蒸馏水10~15分钟,将海棉垫、滤纸(3层)提前浸入转膜液中15min,按透明板、海棉垫、滤纸(3层)、PVDF膜、条带胶、滤纸(3层)、海棉垫、黑板的顺序装入,每张PVDF膜右下角剪去一小角作为方向指标,用移盒玻璃棒赶走气泡(可先浇些转膜液后,用红色板铲刮赶气泡)。
(1)转一张膜需准备6张7.0~8.3cm的滤纸和1张7.3~8.6cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
(4)要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。
)
8.4260mA恒流2h,冰上进行转膜,(转移盒白对红,黑对黑),直至相应的Marker转移至PVDF膜上。
9.封闭
9.1洗膜:
将膜用TBS洗三次,每次5分钟(可不洗);
9.2封闭:
配制含5%脱脂牛奶的TBST:
10XTBS:
24.2gTrisbase,80gNaCl,双蒸水溶解,HCl调PH至7.6,定容至1000ml,4℃保存。
TBST:
1mlTween20,100ml10XTBS,900ml双蒸水,混匀,最好现用现配。
5%脱脂牛奶的TBST:
2.5g脱脂奶粉加入TBST50ml中,溶解后4℃保存。
使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。
依膜0.1ml/cm2封闭)。
震荡仪上震荡1h,TBST洗膜5minX3次。
注:
20%Tween20:
Tween20 20ml 蒸馏水至100ml,混匀后4℃保存。
TBS缓冲液(100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl)
1 mol/ LTris·HCl(pH7.5) 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至1000ml
10.抗原抗体反应
10.1抗体稀释:
用封闭液的TBST牛奶按比例或者BSA稀释一抗,β-action(1:
500~1000)
10.2一抗孵育:
盒子底部铺一张封口膜,滴上抗体,再铺PVDF膜,正面(蛋白面)向上,在另一面也滴上抗体,铺封口膜覆盖,4℃过夜(震荡),次日室温再孵育30min。
10.3洗涤:
取出PVDF膜,TBST洗5min*3次(震荡)。
10.4二抗孵育:
将二抗按1:
5000稀释,用5%TBST牛奶配成5ml量(具体依据二抗说明书),室温孵育1h(震荡)。
10.5洗涤二抗:
TBST洗5次,8min*2次,5min*3次。
11.发光
1、备:
碧云天BeyoECLPlus发光试剂盒、皮镊、滤纸、显影液、X光胶片、水盒保鲜膜、100ml枪2支,1.5mlEP管。
2、将A发光液与B发光液等体积配制成发光工作液,暗室进行,配制2管*1ml。
3、备好保鲜膜,用弯镊将膜取出,垂直在滤纸上沥一下(切勿触膜的蛋白面,然后置于干净保鲜膜上)。
4、均匀滴加1ml发光工作液到PVDF膜上,放置1~2分钟,将膜放在两片保鲜膜之间。
5、在抽屉剪好胶片,置于保鲜膜上,盖上片夹,暗室压片1~2min(依PVDF膜条带强弱而定,若强30s即可)。
6、显影:
显影剂显1~2min,
7、定影1min,入清水。
方法二:
滴加1ml发光工作液后直接将膜置于荧光或成像仪内曝光1~2s.
如进行复显或者重显,用TBST洗膜1h,丽春红染-牛奶封闭-步骤同前-一抗-二抗。
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