尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx
- 文档编号:1011347
- 上传时间:2022-10-15
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:80.97KB
尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx
《尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法
尼克酸(维生素PP-又称烟酸)的测定方法
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法
(1)
此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法(分光光度法)
一、微生物法
1.原理
一种微生物生长必需某一些维生素,Lactobacillusarabinosus的生长需要尼克酸。
尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。
它是白色晶体,是维生素中最稳定的一种,对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定,微溶于冷水,易溶于热水及乙醇。
其检出限为10ng。
2.适用范围
本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。
适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。
3.仪器
(1)电热恒温培养箱(37±0.5℃)
(2)无菌室(紫外灯消毒)
(3)电热手提式压力蒸汽消毒器(121℃,高压30min)
(4)液体快速混合器
(5)离心机(3000转,10min)
(6)碱式滴定管
(7)硬质玻璃试管
4.试剂
所用试剂皆为分析纯;所用水皆为蒸馏水
4.1标准溶液的配制
(1)尼克酸标准储备液(0.1mg/ml):
准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准,以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml,于冰箱中保存。
(2)尼克酸标准中间液(1ug/m):
吸取1.00ml尼克酸标准储备液,置于100ml容量瓶中,用25%乙醇溶液定容,混匀,于冰箱中保存。
(3)尼克酸标准工作液(0.1ug/m):
临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液,置于50ml容量瓶中,用水定容,混匀。
4.2其它试剂的配制
(1)0.5mol/L硫酸:
于2000ml烧杯中加入700ml水,加入28mlH2SO4,用水稀释至1000ml。
(22)琼脂培养基:
无水葡萄糖1g 醋酸钠1g 蛋白胨0.8g 酵母提取物干粉0.2g 甲盐溶液0.2ml
乙盐溶液0.2ml 琼脂1.2g
混合,加水至100ml,加热至琼脂完全溶化,以溴麝香草酚蓝为外指示剂,用盐酸趁热调PH至6.8,尽快倒入试管中,每管3~5ml,加塞棉塞,于压力蒸汽消毒器中121℃灭菌10min,取出后竖直试管,冷至室温后保存于冰箱中。
4.3菌种的制备与保存
(1)菌种的制备与保存:
以阿拉伯乳酸杆菌�Lactobacillusarabinosus17-5ATCCNo.8014简称Lact.A?
纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中,在37±0.5℃恒温箱中保温16-24小时,取出于冰箱中保存,至多不超过两周。
保存数周以上的菌种,不能立即用作制备接种液之用,一定要在使用前每天转种一次,连续2-3天,方可使用,否则生长不好。
(2)种子培养液的制备:
加5ml0.1ug/ml的尼克酸标准应用液于尖头试管中,加入5ml基本培养基,塞好棉塞,于压力蒸汽消毒器内(高压锅)121℃下消毒10min,取出,置于冰箱中,此管可保存数周之久。
5.操作步骤
5.1样品制备:
取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中,加0.5mol/LH2SO450ml。
放入高压蒸汽锅121℃下水解30min,取出,于水中冷却,用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5,用溴甲酚绿做指示剂。
将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至100ml,滤纸过滤,保存滤液于冰箱内备测(保存期不超过36小时)。
*用0.5mol/L硫酸水解,可以断开尼克酸和其它物质结合的键,使尼克酸游离出来。
*观察溴甲酚绿至草绿色为终点,说明溶液PH值到了4.5.调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质,如:
淀粉、脂肪酸及磷脂。
许多蛋白质的等电点也在PH4.5,所以此PH值也可用来沉淀蛋白质。
5.2接种液的制备:
使用前一天,将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中,可同时制备两管,在37±0.5℃的恒温箱中培养16-24小时。
取出离心10分钟(3000rpm)倾去上部液体,用已消毒的生理盐水淋洗2次,再加10ml消毒过的生理盐水,将离心管置于液体快速混合器上混合,使菌种成为混悬体,将此液倒入已消毒的注射器内,立即使用。
5.3样品标准曲线的测定:
3组试管各加0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0ml工作液,每管加水稀释至5ml,再加5ml基本培养基,混匀,加棉塞。
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(4)
5.4试样的测定:
在试管中分别加入1,2,3,4ml样液,加水稀释至5ml,再加入5ml基本培养基,用棉塞塞住试管,将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅(121℃)高压10min,冷至室温备用。
5.5接种和培养:
每管种一滴接种液,于37±0.5℃恒温箱中培养72小时
*注意:
接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。
5.6滴定:
从恒温箱中取出后,将试管中培养液倒入50ml三角瓶中,用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋洗试管,洗液倒入该三角瓶中,以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定,呈绿色即为终点,此时PH约6.8,绘制尼克酸标准工作曲线,用测定管得到的值,在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。
*水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时,不致改变基本培养基的PH值。
(此乳酸菌生长的适宜PH值为6.8)
6.计算
以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标,滴定所需0.1mol/L氢氧化钠毫升数为纵坐标,作为标准曲线。
X=(C×V/m)×F×(100/1000)
X--样品中尼克酸的含量,mg/100g;
C--每毫升样品中尼克酸含量的平均值,ug/ml;
V--样品水解液定容总体积,ml;
F--样品试液的稀释倍数;
m--试样质量,g;
100/1000--折算成每100g样品中尼克酸含量,mg。
7.举例
取一螺旋藻样品1.004g(m),处理后定容为100ml(V),从中取1ml稀释至25ml(F),取1,2,3,4ml入试管中,加入水和培养基,高压消毒,培养,滴定,测量根据曲线分别得出四管C值为0.037,0.073,0.110,0.136,所以四管平均值为C=(0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4)/4=0.036。
代入方程式为:
X=(C×V/m)×F×(100/1000)=(0.036×100/1.004)×25×(100/1000)=8.96(mg/100g)
因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。
8.注意事项
(1)当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug,即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。
(2)3mol/L盐酸的配制方法:
取250ml浓盐酸,加入750ml蒸馏水,共配成1L3mol/L的盐酸
(3)试管应先用洗衣粉清洗后,用水冲净,再放入酸缸中浸泡1天左右,捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净,凉干,方可再用。
完
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(5)
二、比色法
1.原理
烟酸和烟酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取,再与CNBr溶液与10%对氨基苯磺酸反应,测其比色值。
2.适用范围
选自AOAC;适用范围:
适用于药物、食物和饲料
3.仪器设备
(1)容量瓶,100ml
(2)锥形瓶,250ml
(3)电热板
(4)高压釜(121℃,30min)
(5)离心管,5ml
(6)漏斗
(7)通风橱
(8)酸式滴定管
比色计(药物430-450nm,谷物470nm)
4.试剂
所用试剂皆为分析纯;所用水皆为蒸馏水
4.1尼克酸标准溶液
(1)尼克酸标准储备液(100μg/ml):
将50mgUSP烟道参比标准(贮于P2O5干燥器中,放于暗处保存。
)
(2)标准中间液Ι(10μg/ml):
取少量贮备液放置至室温。
用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。
(3)标准工作液Π(4μg/ml):
将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至50ml。
4.2其它试剂
(1)稀氢氧化铵溶液:
5mlNH4OH用H2O稀释至250ml
(2)稀盐酸:
V+V=1+5
(3)磷酸缓冲液(pH=8):
将60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸馏水中并稀释至200ml。
(4)溴化氢溶液(10%,通风橱中制备):
将370mlH2O温热至40℃,并加入40gCNBr。
振荡至溶解冷却并稀释至400ml。
溶液在冰箱保存。
*CNBr剧毒,切勿与皮肤接触,必须在通风橱中操作。
(5)10%对氨基苯磺酸溶液:
按每次1ml将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中,直至酸溶解为止。
用盐酸与蒸馏水溶液(1:
1)调节pH至4.5,采用溴甲酚绿指示剂指示。
稀释至200ml。
*注:
因为溶液有颜色会影响最后结果,所以稀释结束后溶液应几乎无色
(6)55%对氯基苯磺酸溶液:
在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlNH4OH,振摇至溶解。
(必要时加温)。
用NH4OH或5NHCl调pH为7,再用蒸馏水稀释至100ml。
(保存在暗处)
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(6)
5.操作步骤
5.1样品制备
(1)药物:
将药品研碎,溶于蒸馏水中,稀释定容。
取10mL样品于锥形瓶中,加入10mLHCl,在电热板上加热蒸发至约2mL,冷却,加入25-50mL蒸馏水,用40%NaOH或KOH溶液调节pH值至2.5-4.5。
过滤,弃去10mL处液,转移至容量瓶中定容,使溶液含尼克酸约4μg/mL。
*注:
溶液的尼克酸含量应在50-200μg/mL
(2)非谷类食品及饲料:
称取约28g样品,加入0.5mol/LH2SO4200mL,混匀,在高压釜中121℃加热半个小时。
冷却,用10mol/LNaOH调节pH值至4.5,以溴甲酚绿作外指示剂,用蒸馏水稀释至250mL,过滤。
取17g(NH4)2SO4于50mL容量瓶中,吸取40mL样品液,用H2O稀释定容,强力振摇。
过滤,混匀,取1mL作比色测定用。
如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。
最终液浓度3.2μg/mL。
移取40mL标准工作液Π至盛有17g(NH4)2SO4的50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释定容,此液含尼克酸3.2μg/mL。
*注:
加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质,以防其对测量结果造成影响
(3)谷类产品:
随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。
分别将1.5gCa(OH)2放入7个锥形瓶中,移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液Ι和2.5g样品(含100μg烟酸),加入蒸馏水至90mL,振摇混匀。
高压121℃下2小时。
趁热混匀,冷却至40℃,转移至100mL容量瓶中,稀释定容。
从容量瓶移50mL上清液至离心管中,冰浴15min或置于冰箱中≥2小时。
离心15min,吸取20mL上清液至盛有8g(NH4)2SO4和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。
振荡溶解并温热至55-60℃。
离心5min,过滤。
5.2操作程序
(1)药物制剂和非谷类食物和饲料:
假如10%的对氨基苯磺酸溶液,CNBr溶液,在通风橱中用酸式滴定管滴入,用标准工作液Π,如下表制备各管:
试剂标准空白样品空白
标准溶液(mL)1.01.0
H2O(mL)5.05.0
稀NH4OH(mL
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 尼克 维生素 PP 又称 烟酸 测定 方法